选择性识别酪胺分子印迹聚合物的制备及其表征

田艳丽 朱秋劲 台红杏 黄雨杰 张孝刚

TIAN Yan－li 1 ZHU Qiu－jin 1 TAI Hong－xing 1 HUANG Yu－jie 1 ZHANG Xiao－gang 2

（1.贵州大学酿酒与食品工程学院，贵州 贵阳 550025；2.遵义医学院，贵州 遵义 563003）

（1.College of Liquor Making and Food Engineering，Guizhou University，Guiyang，Guizhou 550025，China；2.Medical College of Zunyi，Zunyi，Guizhou 563003，China）

酪胺又名对羟基苯乙胺（分子量137.18），是一类含氮低分子量的单胺类生物胺，对血管和肌肉有着明显的舒张和收缩作用，对精神活动和大脑皮层具有重要的调节作用［1］。该化合物具有升高血压和兴奋子宫的药理作用，可用来制备偏头痛的药物［2］。生物胺广泛存在于各类食品中，在富含蛋白质和氨基酸的食品中相对较多［3］，其中发酵香肠、泡菜、干酪、酸奶、葡萄酒［4］、黄酒［5］等发酵食品在发酵过程中容易产生生物胺。通常，少量的酪胺不会对人体产生影响，但当积累到一定的浓度时，不仅影响食品风味，甚至对人体产生毒害作用［6－8］。在正常的食用植物油中并不含有生物胺，地沟油中生物胺主要由其原料中腐败变质的蛋白质所产生，为地沟油所特有［9］。目前中国尚无鉴别地沟油的依据，而测定其中生物胺含量，不但可以对地沟油进行鉴别，而且还能测定其中对人体有毒害作用的生物胺类物质［9］。目前常用的酪胺检测方法包括酶生物传感器法［10］、薄层色谱法［11］、气相色谱法［12］、高效液 相 色 谱 法［13］、电 泳 法［14］等。但 是 这 些 方 法的成本较高，且在检测前需要进行复杂的预处理，应用很不方便。

分子印迹技术是近来集高分子合成、分子识别、分子设计等众多学科优势发展起来的一门边缘学科分支，近几十年来在国内外的发展十分迅猛，在多个领域都得到了应用。其基本原理是在一定的制孔剂（如甲醇、乙腈、二甲基亚砜、二氯甲烷等）中，模板分子和功能单体依靠分子间的相互作用构成单体—模板分子复合物；再加入交联剂，在引发剂的作用下，聚合形成稳定的高交联的聚合物；选用合适的溶剂洗脱模板分子，制备出具有选择吸附性能的聚合物［15］。聚合物具有容易制备、化学性质相对稳定等优点，已广泛的应用于食 品［16，17］、环 境［18］、生 物［19，20］及 药 物［21，22］等 领 域。分 子印迹聚合物在目标物的分离富集检测方面有很好应用，利用其特异选择吸附结合性能，与传感器联用可以构建酪胺的快速检测方法。因此，分子印迹技术在食品安全检测方面具有重要的应用潜力［16］。

本研究拟以酪胺为模板分子，丙烯酰胺（AM）为功能单体，采用本体聚合的方法，制备聚合物。通过吸附动力学和吸附等温试验，对其吸附性能进行研究；并且选择结构类似物组胺研究印迹聚合物的分子识别特性。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

酪胺（tyramine）、丙烯酰胺（acrylamide，AM）：纯度大于99.9%，美国Sigma－Aldrich公司；

乙二醇二甲基丙烯酸酯（ethylene glycol dimethacrylate，EGDMA）：99%，百灵威科技有限公司；

偶氮二异丁腈（2，2＇－azobis（2－methyl），AIBN）：分析纯，成都格雷西亚化学技术有限公司；

乙 腈：HPLC 级，Tedia Company，Inc.，1000 Tedia Way，Fairfield，OH45014.USA；

甲醇、冰醋酸：分析纯，天津市富宇精细化工有限公司；

氮气：贵州省贵阳市花溪区永胜工业气体。

1.1.2 主要仪器设备

超声波清洗仪：HB 3120U型，江苏汉邦科技有限公司；

紫外—可见分光光度计：TU－1810型，北京普析通用仪器有限责任公司；

数显恒温振荡器（水浴）：WHY－2型，上海梅香仪器有限公司；

恒温恒湿培养箱：CLHN－350T型，天津市华北实验仪器有限公司；

磁力搅拌器（自行改装后四套并排组装可控转速）：CJ78－1型，金坛市城东新瑞仪器厂；

电热恒温水浴锅：HH－S6型，北京科伟永兴仪器有限公司；

冰箱：BCD－235CM 型，合肥美的荣事达电冰箱有限公司；

电热鼓风干燥箱：101－2A型，天津市泰斯特仪器有限公司；

高效液相色谱仪：1260 Infinity型，美国 Agilent Technologies公司；

傅里叶变换红外光谱仪：VECTOR22 FTIR型，德国Bruker光谱仪器公司。

1.2 分子印迹聚合物的制备

取0.5 mmol（67.5 mg）酪胺溶解在50 m L的甲醇中，加入4 mmol（284.3 mg）AM 功能单体，室温下超声促溶，于4℃冰箱中预聚合12 h。再加入10 mmol（1.9 m L）EGDMA和20 mg AIBN，混匀后通氮气20 min以除去混合液中溶解的氧气，将反应器密封于3～4℃、365 nm紫外光照射，恒速磁力搅拌下聚合48 h。采用相同的方法，不加模板分子制备酪胺的非印迹聚合物（NIPs）。

取出聚合后的三角瓶，于超声波下超声3次分散聚合物，过滤除去溶剂。干燥后研磨过筛（400目），用10%冰醋酸甲醇溶液于索氏抽提装置，抽提48 h（75℃水浴）除去模板分子，洗涤聚合物至在波长216 nm处检测不到酪胺分子的特征吸收，用丙酮沉降除去精细粒子，真空干燥后备用。

1.3 分子印迹聚合物的表征

利用傅立叶变换红外光谱仪，采用溴化钾（KBr）压片法测定酪胺、MIPs－AM 和 NIPs－AM 在4 000～400 cm－1范围内的红外光谱图，并分析比较。

1.4 模板分子和功能单体相互作用的紫外光谱分析

1.4.1 单体AM加入量对预组装体系的紫外光谱测定 取2 mmol／L酪胺甲醇溶液120μL加入10 m L比色管中，分别加入浓度为3 mmol／L的单体AM甲醇溶液，使酪胺与单体AM浓度比分别为1∶2，1∶4，1∶6，1∶8，1∶10，用甲醇定容至10 m L，振荡混匀后于4℃静置12 h，以相应浓度单体AM甲醇溶液为参比，于350～190 nm进行紫外光谱扫描。

1.4.2 预组装体系的差示紫外光谱测定 取2 mmol／L酪胺甲醇溶液120μL加入10 m L比色管中，分别加入浓度为3 mmol／L的单体甲醇溶液，使酪胺与单体AM浓度比分别为1∶2，1∶4，1∶6，1∶8，1∶10，用甲醇定容至10 m L，振荡混匀后置于4℃静置12 h，以酪胺标准溶液作参比，于350～190 nm进行紫外光谱扫描。

1.5 MIPs对酪胺的吸附动力学试验

于一组10 m L带塞离心管中各取印迹聚合物20 mg，加入10μmol／m L的酪胺水溶液5 m L，于30℃恒温水浴振荡培养箱中振荡不同的时间，高速离心机10 000 r／min离心10 min，然后取离心液1 m L，衍生后用乙腈定容至5 m L［23］，于高效液相上检测。根据上清液中剩余的酪胺的浓度，按式（1）计算聚合物对酪胺的吸附量Q，观察吸附量Q随时间的变化趋势。

式中：

Q——聚合物的吸附量，μmol／g；

C0、C1——分别是吸附前后模板分子的初始浓度和平衡浓度，μmol／m L；

V——溶液的体积，m L；

MMIPs——印迹聚合物的质量，mg［22］。

1.6 吸附等温线的测定

于一组10 m L带塞离心管中各取印迹聚合物MIPs和非印迹聚合物NIPs 20 mg，分别加入不同浓度的酪胺水溶液5 m L，于30℃恒温水浴振荡培养箱中振荡8 h，高速离心机10 000 r／min离心10 min，然后取离心液1 m L，衍生乙腈稀释定容至5 m L，于高效液相上检测。根据吸附前后酪胺浓度的变化，计算平衡时MIPs和NIPs的吸附量Q。

1.7 酪胺分子印迹聚合物的特异性吸附

取1.0μmol／m L的酪胺水溶液和组胺水溶液各5 m L，分别加入印迹聚合物MIPs和非印迹聚合物NIPs各20 mg，于30℃恒温振荡培养箱中振荡不同的时间，10 000 r／min离心10 min，取离心液1 m L，衍生乙腈稀释定容至5 m L，于高效液相上检测。根据吸收峰面积的大小，计算平衡时酪胺的浓度，通过前后浓度的变化，得到单位质量的聚合物对酪胺和组胺的吸附量。

1.8 高效液相色谱检测条件

色谱柱：Hanbon Sci.＆ Tech.Dai ODS－P柱（4.6 mm ×250 mm，5μm）；流动相A为乙腈，流动相B为水，乙腈的梯度洗脱程序：0～5 min（65%～70%），5～20 min（70%～100%），20～24 min（100%），24～25 min（100%～65%）；流速为1 m L／min；检测波长为216 nm；进样量20μL；柱温为30℃。

2 结果与讨论

2.1 酪胺、MIPs和NIPs的红外光谱试验

酪胺、MIPs和NIPs的红外光谱结构表征见图1。图中印迹聚合物和非印迹聚合物的红外图谱峰形相似，且MIPs中没有看到酪胺苯环C骨架伸缩振动的特征峰（1 595.06，1 515.77，1 483.28 cm－1），这说明 MIPs中的模板分子已经洗脱干净。酪胺属于芳胺类化合物，C—N的伸缩吸收相当强，接近1 300 cm－1；酪胺是伯胺，有两个N—H键，3 335.63 cm－1和3 283.24 cm－1为 N—H 键的对称和反对称伸缩振动吸收峰。在MIPs和NIPs的红外图中，3 436.28，3 436.26 cm－1为 N—H 的 伸 缩 吸 收 峰；2 998.16，2 955.35 cm－1和 2 987.39，2 955.39 cm－1是—CH3或—CH2的反对称和对称伸缩振动吸收峰；1 388.89，1 453.43 cm－1和 1 389.12，1 453.17 cm－1为—CH3的 对称弯曲振动和反对称弯曲振动吸收峰；酰胺的C═O谱带低于酮的羰基吸收峰，在1 690～1 630 cm－1处；因为聚合物是由乙二醇二甲基丙烯酸酯（EDGMA）作交联剂聚合得来，而酯的C═ O伸缩振动稍高于酮，所以在1 726.39，1 726.86 cm－1处可以看到酯的C═O的伸缩振动吸收峰；在1 157.10，1 262.84 cm－1和1 157.14，1 261.51 cm－1处有酯的C—O—C的不对称伸缩振动和对称伸缩振动吸收峰［22］。

2.2 模板分子酪胺和功能单体AM聚合前相互作用的紫外光谱分析

2.2.1 单体AM的加入量对预组装体系紫外光谱测定 印迹聚合物对模板分子识别是因为模板分子与印迹聚合物上的互补作用位点的可逆相互作用。因此，研究聚合前模板分子和功能单体预组装体系的相互作用对于探讨印迹聚合物的识别机理有一定的意义［24］。

图1 酪胺、MIPs－AM和NIPs－AM的红外光谱Figure 1 IR spectra of tyramine，MIPs－AM and NIPs－AM

图2 单体的加入量对预组装体系紫外光谱的影响Figure 2 Effect of monomer content on pre－assembed system UV spectrum

由图2可知，随着AM浓度的增加，预组装体系的紫外光谱吸光值呈降低的趋势，这说明酪胺与单体AM的相互作用逐渐增大，而且预组装体系的最大吸收波长发生了红移现象，这是由于模板分子酪胺的助色团羟基（—OH）和氨基（—NH2）通过氢键与功能单体的生色团羧基（—COOH）或酰胺基（—CONH2）相互作用，功能单体中羰基—C═O的电子吸收能量发生π－π＊跃迁，使得生色团的吸收峰向长波方向移动。

2.2.2 预组装体系差示紫外光谱测定 差示紫外光谱经常用于研究分子印迹预组装体系中结合常数K和主客体之间的化学配比n［25－27］。该方法主要是通过检测模板与模板－单体混合物的差示吸光度ΔA，然后绘制差示吸光度ΔA和单体浓度bn（n＝1、2、3……代表结合反应的摩尔比）的化学配位数幂bn之比ΔA／bn与ΔA的曲线，通过曲线的线性相关度来计算n和K［27］。

图3 预组装体系的差示紫外光谱图Figure 3 Pre－assembed system UV spectrum of differential

参照文献［27］、［28］，酪胺（TYR）与丙烯酰胺（AM）的结合反应公式推导和整理得如下表达式：

式中：

ΔA——差示吸光度；

a——酪胺的浓度，mmol／L；

b——丙烯酰胺（AM）的浓度，mmol／L；

K——TYR与AM的结合反应常数；

Δε——TYR－AM复合物与AM的摩尔吸光系数差值，L／（mol·cm）；

n——复合物的配位比，取n＝1，2，3，……。

图4 224 nm处ΔA／bn对ΔA的关系图Figure 4 Plots ofΔA／b n vs，ΔA at 224 nm

根据差示紫外光谱测定得到的吸光值，以ΔA／bn对ΔA作图，由图4可知，当n＝1时，对ΔA 作图可以看作是一条直线，相关系数是0.935 5，显示了比较良好的线性。当n取2，3，4时，相关系数分别是0.790 8，0.647 4，0.545 5，没有良好的线性。这说明1个酪胺分子主要是与1个AM分子形成TYR－AM 型复合物，K＝31.711×103L／mol。

2.3 MIP对酪胺的吸附动力学分析

按照1.5试验方法测定不同的吸附时间MIPs对酪胺的吸附量，以时间T为横坐标，对吸附量Q作图，得到聚合物的吸附动力学曲线，见图5。由图5可知，前4 h聚合物的吸附量随着时间的延长而迅速增加，4 h后吸附速率有所下降，8 h后逐渐趋于平稳。这是因为MIPs是由交联剂和功能单体构建的空穴组成，本身分布就不完全均匀。而且在本体聚合完成后，经过研磨，产生了深浅不一的孔穴。吸附的初始阶段，浅穴对模板分子的吸附较快，而当浅穴吸附饱和时，就会对吸附产生一定的阻碍作用，导致吸附速率下降，但在8 h后基本完成了对酪胺的吸附［29］。

图5 MIPs吸附动力学曲线Figure 5 Absorption dynamics curve of polymer

2.4 酪胺分子印迹聚合物的吸附特性

用Langmuir吸附等温方程对体系中吸附量与平衡浓度的关系：

式中：

Q——单位质量聚合物的吸附量，μmol／g；

Qmax——吸附平衡时聚合物的最大吸附量，μmol／g；

Ceq——平衡时溶液中酪胺的浓度，μmol／m L；

KD——平衡解离常数；

C——酪胺溶液的浓度，μmol／m L。

在0.7～1.5μmol／m L的浓度范围内，以 C—Q 作图（图6），曲线符合Langmuir吸附等温曲线，印迹聚合物和非印迹聚合物的吸附量均与吸附液初始浓度的大小有关，都随着酪胺溶液浓度的增大而增加。同时可以很明显看出印迹聚合物的吸附量大于非印迹聚合物的吸附量，这表明组成成分相同的两种聚合物的空间结构是不同的，印迹聚合物中含有与模板分子酪胺功能基团相匹配的空间位穴。用分子印迹中常采用的Scatchard模型来评价聚合物的结合特性，Scatchard方程式：

以Q／Ceq对Q作图，MIPs对酪胺的结合曲线结果显示为一条线性关系比较良好的直线：y＝－1.277x＋409.007（R2＝0.931 9），根据直线的斜率和截距，计算得出结合位点的平衡解离常数KD＝0.783μmol／m L，最大表观吸附量Qmax＝320.29μmol／g；NIPs的拟合结果的相关系数R2＝0.576 5，KD＝1.27μmol／m L，Qmax＝221.93μmol／g。据此判断：在分子印迹聚合物中存在酪胺的特异性结合位点，而非印迹聚合物对酪胺的吸附特性不明显。

图6 MIPs和NIPs的吸附等温线Figure 6 Absorption isotherms curves of MIPs and NIPs

2.5 酪胺分子印迹聚合物对酪胺的选择性

选取与酪胺结构类似的化合物作为分析物，用静态吸附的方法测定印迹和非印迹聚合物对底物的吸附量Q，并计算分离因子α和印迹效率β，其中α为聚合物对酪胺的吸附量与聚合物对类似物的吸附量的比值，β为印迹聚合物的分离因子与非印迹聚合物的分离因子的比值。

由表1可知，印迹聚合物对酪胺的吸附量为124.04μmol／g，明显高于对苯乙胺、组胺和亚精胺的吸附量，而非印迹聚合物对底物吸附量没有明显的区别。印迹聚合物对酪胺的分离因子α分别为1.20，1.41，1.54，可以看出印迹聚合物对酪胺的结构类似物都有较好的吸附选择性，但是对组胺、亚精胺的吸附选择性比对苯乙胺的强，这是因为苯乙胺的结果与酪胺的结构十分类似。

其印迹效率β为1.24，1.47，1.57，表明分子印迹聚合物对酪胺具有较好的选择性吸附作用。

表1 印迹聚合物和非印迹聚合物分离因子α和印迹效率β的比较Table 1 Separation factorαand a imprinting efficiencyβ of MIPs and NIPs

3 结论

（1）以酪胺为模板分子，AM为功能单体，制备的印迹聚合物，对模板分子酪胺具有比较高的吸附性能，对组胺的吸附也体现出特异性识别的能力。

（2）通过红外和紫外光谱分别对聚合物和预组装体系进行表征研究，结果说明在研究的浓度范围内，1个酪胺主要是与1个AM分子形成TYR－AM型复合物，K＝31.711×103L／mol。

（3）采用Scatchard模型评价了酪胺分子印迹聚合物的结合性。在试验研究的浓度范围内（0.7～1.5μmol／m L），聚合物对模板分子酪胺有单一的结合位点，和紫外预组装的研究结果一致，拟合分析得出最大吸附量和平衡解离常数分别是Qmax＝248.33μmol／g和KD＝1.76μmol／m L，体现了较好的吸附效果。

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