南瓜多糖的提取及其抗氧化活性研究进展

刘 颖 梁 盈 林亲录

LIU Ying 1，2 LIANG Ying 1，2 LIN Qin－lu 1，2

鲁 倩1，2 田明慧1，2 朱凤霞1，2

LU Qian 1，2 TIAN Ming－hui 1，2 ZHU Feng－xia 1，2

（1.中南林业科技大学，湖南 长沙 410004；2.稻谷及副产物深加工国家工程实验室，湖南 长沙 410004）

（1.Center South University of Forestry ＆ Technology，Changsha，Hunan 410004，China；2.National Engineering Laboratory for Rice and By－product Deep Processing，Changsha，Hunan 410004，China）

南瓜又名麦瓜、番瓜、倭瓜、金冬瓜，为葫芦科属植物，含有淀粉、蛋白质、胡萝卜素、维生素VB、VC和钙、磷等营养成分，不仅具有较高的食用价值，还具有良好的降血糖、降血压、防癌保健等药用价值［1］。其中的主要成分为南瓜多糖。南瓜多糖是一种非特异性免疫增强剂，能提高机体免疫功能，促进细胞因子生成，通过活化补体等途径对免疫系统发挥多方面的调节作用［2］。南瓜多糖具有降血糖、降血脂、抗癌、抗氧化等作用［3－6］，此外，它还可以清除机体在代谢过程中产生的多种自由基包括超氧阴离子自由基（O）、羟自由基（·OH）及其活性衍生物H2O2等［7］。文章拟以南瓜多糖为研究对象，对近年来国内外在南瓜多糖分离提取技术、抗氧化活性及分子修饰对其抗氧化功能带来的影响等方面的研究进行概括阐述，以期为寻找和开发一种新型的天然抗氧化剂提供理论参考。同时也为南瓜多糖在食品和医药方面的应用研究提供理论依据。

1 南瓜多糖的提取方式

1.1 热水浸提法

热水浸提法是一种常用提取方法，其操作简单，但耗时长，得率低。游见明［8］对南瓜多糖的热水浸提工艺进行了优化。结果表明，在料液比1∶12（m∶V），提取温度65℃下提取150 min，南瓜多糖的提取率为2.1%左右。王强等［9］将南瓜于65℃下进行干燥，粉碎得南瓜皮粉，再在液料比25∶1（V∶m），提取温度95℃热水中提取2次，每次提取2 h，并采用Sevage法脱蛋白（8次），其南瓜多糖得率为3.52%。推测前者提取率略低的原因可能是材料未经过预处理，导致南瓜多糖溶出不充分；此外，原料来源不同也可能是造成提取率不同的原因之一。

1.2 超声辅助法

超声辅助法是在不改变提取物生物活性的前提下，先利用超声波破坏植物细胞壁，来缩短提取时间，但因设备限制难以规模化生产。向灿辉［10］以80℃下干燥、粉碎制备的南瓜粉为原料，对其多糖的超声辅助提取工艺进行优化。结果表明，在低功率，提取温度80℃，提取时间6 h的条件下，南瓜多糖的提取率为5.32%。王强等［9］以于65℃下干燥、粉碎制备的南瓜皮粉为原料，对其多糖的超声辅助提取工艺进行优化。结果表明，在功率600 W，提取温度65℃，提取次数2次，每次提取时间1 h的条件下，南瓜多糖的提取率约为4.43%。二者存在差异的原因可能是在高功率的超声处理下，南瓜中的糖类成分有所流失（如单糖、低聚糖等小分子物质），造成得率减少。当然原料来源不同也可能是造成提取率不同的原因之一。

1.3 微波辅助法

微波辅助法同样可以缩短提取时间，但也因设备原因，难以实现规模化生产。赵二劳等［11］对南瓜多糖的微波辅助提取工艺进行了优化，得出最佳的提取工艺为料液比1∶110（m∶V），微波功率360 W，提取时间3 min。该条件下南瓜多糖的提取率可达3.54%。王强等［9］以于65℃下干燥、粉碎制备的南瓜皮粉为原料，在功率600 W条件下微波处理6 min，并进行Sevage法脱蛋白（8次），其南瓜多糖的得率为4.52%。上述试验说明，原料来源、微波功率、微波作用时间均可能会对南瓜多糖的提取率造成影响。

1.4 酶法

酶提取法是一种较为有效的提取方法，它可分解细胞壁使多糖更易析出，且可以降解蛋白质，具有条件温和、杂质易除和得率高等优点。常用的酶有纤维素酶、木瓜蛋白酶、果胶酶等。于翠芳等［12］采用纤维素酶对南瓜多糖的酶法提取条件进行了优化。结果表明，在料液比1∶30（m∶V），纤维素酶浓度0.7%，提取温度50℃，冷冻时间30 h的条件下，南瓜多糖的提取率为12.15%。孙婕等［13］对南瓜多糖的复合酶法提取工艺进行了优化。结果表明：采用纤维素酶1.0%，果胶酶1.5%，木瓜蛋白酶1.0%的复合酶，在温度40℃，p H 4.6，料液比1∶30（m∶V），时间30 min条件下南瓜多糖的提取率可达到20.13%。前者仅采用纤维素酶，而后者采用纤维素酶、果胶酶及木瓜蛋白酶，其提取率约是前者的1.65倍，且操作更简便。说明多种酶协同提取效果优于单一酶。

1.5 其他方法

缓冻可以使植物细胞内产生冰晶，使细胞组织易受损破碎，能强化多糖的提取，且不会破坏物质结构和性质。于斐等［14］研究表明缓冻处理可以有效提高南瓜多糖得率。向灿辉等［10］将于80℃下干燥制备的南瓜粉冻结处理24 h后，取出迅速融化，并于80℃下提取6 h，经脱色和脱蛋白处理后，南瓜多糖得率为5.74%；而在冻融提取法的基础上辅以超声处理南瓜多糖提取率为6.05%。丁宏伟等［15］对微波辅助超声提取南瓜多糖的工艺条件进行优化。结果表明，在料液比1∶4（m∶V），微波处理3 min，超声处理30 min，温度70℃的条件下，南瓜多糖的提取率为3.65%。刁文超等［16］对超声波协同复合酶法提取南瓜多糖的工艺条件进行了优化。结果表明，其最佳的工艺条件为功率440 W、提取温度51.5℃、液料比7∶1（V∶m）、p H 4.4，此条件下，南瓜多糖的得率为4.39%。上述研究表明，微波、超声、酶法协同提取时，可能对南瓜多糖结构和性质产生了破坏，导致其得率下降。

综上所述，原料不同导致的提取率差异不大，但不同方法所带来的提取率差异较为明显。如表1所示，酶法提取南瓜多糖的得率最高，其次是超声波辅助法，提取率最低的是传统水浴法。这是因为在水浴条件下，无法破坏细胞壁，导致南瓜多糖不能完全释放出来。与单一提取方法相比，超声协同复合酶法却没有复合酶法提取率高，这可能是由于超声对酶造成结构破坏，导致酶活性部分丧失，故提取率下降。微波与超声波协同使用没有单独提取得率高，这是因为微波处理后破坏了植物的细胞壁，使大量的多糖流出，再用超声处理就会导致多糖结构的破坏，而无法被收集。相比较几种提取方法，冻融辅助法相较其他协同方法是最为理想的方式，该方式提取率高，不破坏多糖结构，且提取率成本低。

表1 不同方法提取南瓜多糖的比较Table 1 Comparison of different methods to extract Pumpkin Polysaccharide

2 南瓜多糖体外抗氧化活性

2.1 消除自由基的能力

自由基的清除是利用氧自由基的氧化或还原性质，使反应体系中的某种反应物发生氧化或还原反应，生成物在紫外或（和）可见光范围内某一特定波长下具有最大吸收峰，通过测定反应体系在这一波长下的吸光度的变化，间接测定氧自由基的含量。其常用方法有DPPH（1，1－二苯基－2－三硝基苯肼）法、水杨酸法、超氧阴离子法等。孙婕等［6］在用不同方法提取的南瓜多糖进行清除羟自由基试验时得出：相同质量浓度下，复合酶法提取所得的南瓜多糖清除羟基自由基（OH·）的能力最强，在南瓜多糖浓度0.3 mg／m L时清除率为40%左右，在1.8 mg／m L时可达83.2%。在清除超氧阴离子试验中，浓度为20 mg／m L时，酶法提取的多糖清除率可达62.3%。丁宏伟等［15］采用微波辅助超声技术提取南瓜多糖，并测定南瓜多糖对·OH、O及DPPH自由基的清除效果。结果显示，不同浓度南瓜多糖对自由基均有较好的清除效果，特别是4 mg／m L以上时，清除效果显著，清除超氧阴离子的效果最为显著。综上所述，不同提取方法对南瓜多糖清除自由基能力的效果不同，酶法提取的能力最强，而采用微波辅助超声提取清除超氧阴离子的效果最好。

2.2 还原能力

测定物质还原能力一般采用FRAP法，其中Fe3＋吡啶三吖嗪可被样品中还原物质还原为二价铁形式，呈现出蓝色，并于593 nm处具有最大吸收，根据吸光度大小计算样品的抗氧化活性的强弱。李筱泉等［17］通过FRAP法测定了南瓜多糖的总还原能力。发现随着多糖浓度的增加，总还原能力逐渐增强。当南瓜多糖浓度为8 mg／m L时，其总还原能力相当于0.66 mmo L／L Fe2＋。刁文超等［18］用 FRAP法测定南瓜多糖的总还原能力，得出南瓜粗多糖的总还原能力为0.182 mmo L／g，说明南瓜多糖具有一定的还原能力。

2.3 离体抗氧化活性能力

目前筛选及评价抗氧化活性成分的体外试验方法主要包括化学测定法和细胞模型法［19］。化学测定法主要通过化学方法测定样品对脂类物质氧化的抑制能力，或对人工生成自由基的清除能力，继而进行活性评价。而以细胞培养为基础的活性筛选模型是用来研究药物分配进入细胞膜、药物吸收、与载体或酶等生物大分子相互作用以及清除细胞内氧自由基的有效方法，能更准确地阐述在生物体内的抗氧化反应机理［20］。李俊丽［21］研究了南瓜多糖体外抗氧化活性能力，发现南瓜多糖可抑制红细胞的氧化损伤，保护红细胞膜；当南瓜多糖浓度为625～2 500μg／m L在415 nm下红细胞溶血率为68.08%～34.99%，溶血率随多糖浓度的增加而降低。同时，不同剂量的南瓜多糖可以抑制小鼠肝中的丙二醛（MAD）含量，在浓度为2 500μg／m L其 MDA抑制率可达64.09%，抑制率与多糖浓度呈正相关。研究南瓜多糖对Vc＋Fe2＋诱导小鼠肝线粒体肿胀抑制作用过程中，当南瓜多糖浓度达3.75 mg／m L时，几乎可以完全抑制Vc＋Fe2＋诱导作用，其变化与正常组一致。王运强［22］在温度为80，60，40，20℃水浴条件下提取南瓜中的多糖（pumpkin polysaccharide，PP），得到4种水溶性南瓜多糖 PP4、PP3、PP2和PP1，经小鼠体外抗氧化试验，发现南瓜多糖浓度的逐渐增大，对小鼠肝匀浆自发性脂质过氧化抑制能力逐渐加强。其中抑制能力最强的是PP1。当4种水溶性南瓜多糖浓度均为2 mg／m L时，对小鼠肝线粒体肿胀有抑制作用。效果最显著的也是PPl。推测是由于温度过高对南瓜多糖提取造成负影响，造成其活性物质的部分损失，导致其细胞内清除自由基的能力降低，因此低温提取条件得到的南瓜多糖脂质过氧化抑制能力最强。

3 南瓜多糖的体内抗氧化活性研究

3.1 南瓜多糖的消化率

南瓜中所含果胶为天然的低甲氧果胶，在没有糖存在的情况下可以形成稳定的凝胶，保护胃粘膜，加快溃疡面愈合，对消化道溃疡具有一定疗效。另一方面南瓜所含成分（如多糖、膳食纤维等）能促进胆汁分泌，加强胃肠蠕动，帮助食物消化［23］。金晖等［24］探讨了南瓜多糖在体外模拟人工胃液中的动态变化过程，发现随胃酸与胃酶作用时间的延长，还原糖的量缓慢增加，高效凝胶渗透色谱结果显示作用30 min时出现小分子糖，其还原糖量为0.259 8μg／μL，作用90 min时大分子量多糖出现明显变化，得出南瓜多糖在摄入人体30 min内就被人体所消化吸收，而同样条件下红薯淀粉在人工胃液中的还原糖量为0.087 55μg／μL，可以推测出南瓜多糖是较易被人体消化吸收的［25］。

3.2 动物试验

众所周知，随着年龄的增长，体内自由基含量增多，T细胞受损，免疫功能下降，导致衰老，同时带来心脑血管疾病的隐患。研究发现某些多糖既可以从整体上提高机体的免疫功能［26］；又可以抑制脂质过氧化、增强机体对自由基的清除能力［27］，延缓衰老［28］，抑制心脑血 管疾病的发生［29］。朱 红艳等［30］建立了用胰岛素和高糖来诱导的胰岛素抵抗脂肪细胞模型，并验证南瓜多糖对胰岛素抵抗脂肪细胞是否具有保护作用。结果表明，南瓜多糖可以增加胰岛素抵抗脂肪细胞对葡萄糖的消耗，而胰岛素抵抗脂肪细胞中PPARγ表达明显低于正常对照组。说明南瓜多糖可能通过提高PPARγ的表达来改善胰岛素抵抗脂肪细胞模型的胰岛素抵抗性。潘洪志等［31］采用灌胃的方式来观察染铅小鼠抗氧化系统的改变及南瓜提取物对抗氧化酶系统的影响。结果得出铅中毒可以引起小鼠过氧化损伤，南瓜多糖可以减轻铅中毒引起的脂质过氧化，提高小鼠机体的抗氧化能力。刘颖等［32］将糖尿病大鼠根据血糖和体重随机分为糖尿病组和南瓜多糖组，同时与正常组进行对照，并分别给予蒸馏水和南瓜多糖灌胃，每周测量体重1次，4周后测定大鼠的血清总胆固醇、空腹血糖、高密度脂蛋白、甘油三酯、游离脂肪酸和低密度脂蛋白的含量。结果表明，糖尿病组大鼠的高密度脂蛋白、甘油三酯、游离脂肪酸和低密度脂蛋白含量显著增加，血液中高密度脂蛋白含量明显降低，补充南瓜多糖后，甘油三酯、总胆固醇、游离脂肪酸和低密度脂蛋白含量明显降低，而高密度脂蛋白含量升高，南瓜多糖的降脂效果明显。证明南瓜多糖能够有效预防心脑血管疾病的发生。

4 通过分子修饰提高南瓜多糖的抗氧化活性

南瓜多糖除本身具有抗氧化功效外，将其分子进行适当的化学修饰后得到的多糖较修饰前具有更高的活性或者产生新的活性。

4.1 羧甲基化

甲基化方法是分析多糖及其缀合物中糖结构和性质的重要方法，可将多糖中各种单糖结构中的游离羟基全部甲基化，并将甲基化多糖进行水解得到部分甲基化的单糖，通过分析水解后的单糖，来推测多糖分子中各单糖间连接位置［33］。多糖甲基化方法很多，如Purdie法、Cicanu法、Menzies法、Haworth法、Hakomori法及液氨甲基化等。柳红等［34］采用超声辅助法提取南瓜多糖并对其进行分离和羧甲基化；邻苯三酚自氧化法测定羧甲基南瓜多糖对超氧阴离子自由基的清除作用，结果证明羧甲基化后的南瓜多糖具有更好的抗氧化活性。

4.2 硫酸化

在结构修饰中，硫酸酯化是一个颇为有效的修饰手段，多糖大分子中单糖的某些羟基用硫酸根取代，进而加强了多糖分子的固有生物活性。但其稳定性还需进一步研究。谢佳等［35］采用氯磺酸—吡啶法，对南瓜粗多糖和分离得到的南瓜PP1多糖进行硫酸酯化，结果表明水提南瓜多糖、水提南瓜AP1多糖（采用十六烷基三甲基溴化铵沉淀法，即CTAB法沉淀得到南瓜多糖为南瓜AP1多糖）、硫酸酯化水提南瓜多糖、硫酸酯化水提南瓜AP1多糖南瓜多糖均能有效清除·OH，随着浓度的上升，清除效果愈明显，且采用水法提取的南瓜粗多糖对·OH清除作用明显优于另外3种多糖。而南瓜AP1多糖和南瓜粗多糖对O的清除作用不显著，但经硫酸酯化的多糖可以有效清除O，且呈量效关系。孔倩等［36］采用三氧化硫—吡啶法对南瓜多糖PL2－1进行硫酸酯化修饰，但硫酸酯化修饰取代度不高。其原因可能是南瓜多糖的游离羟基不多，供硫酸酯化的机会较低。

4.3 磷酸化

多糖不仅本身具有多种生物活性，它们的衍生物也具有独特的作用。磷酸酯是多糖衍生物中重要的一类，也是研究多糖构效关系的重要组成部分，对开发多糖药物具有深远意义。常用于多糖磷酸化的试剂有：三氯氧磷、磷酸及其酸酐、磷酸盐等。吴琼等［37］用三氯氧磷（POCl3）对银耳多糖进行处理，并在60℃恒温水浴锅中反应40 min，分离得到了4种磷酸化银耳多糖。银耳多糖中羟基的取代度越大，溶解性越好，并进行体外清除自由基试验，结果表明，修饰后的银耳多糖与修饰前的相比清除DPPH自由基能力明显增强。由此推测南瓜多糖也可做类似修饰来改变其分子结构，进而提高或改变其化学性质和生理活性，为今后的应用提供了方向。

从上述结果可以看出无论是经过羧甲基化、硫酸酯化还是磷酸化都提高了南瓜多糖体外清除自由基的作用。硫酸酯化与多糖中游离羟基含量有关，而磷酸化产物结构可控性较差，增加了难度。多糖的硫酸酯化和磷酸化同为聚阴离子修饰，却因其合成方面的瓶颈而没有得到广泛而系统的研究。而羧甲基化制备过程简单，试剂成本低，产物无毒性等特点，是一种比较理想的衍生方法。

5 展望

多糖为非细胞毒性物质，药物质量可通过化学手段进行控制，并且毒副作用小，在医药学研究领域有着相当广阔的应用前景。由于南瓜多糖成本低廉，操作简单深受企业的青睐，为其开发利用提供了广阔的市场。目前对其研究报道主要集中在降血糖、降血脂方面，而对南瓜多糖抗氧化活性及其作用机制的研究还未见详细报道，其体内水平、动物水平、细胞水平及分子水平的抗氧化活性机理的研究均不透彻，还有待进一步深入探讨。此外，关于南瓜多糖结构修饰及其带来的影响还不够清晰，对南瓜多糖进行结构修饰而改变其抗氧化性、溶解性等其他功能性质，也是后续的研究方向之一。

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