超高效液相色谱-飞行时间质谱联用分析清热凉血方中的化学成分*

鹿见香赵 铁 曾伟贤 马雪婷 吕景晶 白彦萍△

（1.北京中医药大学，北京 100029；2.中日友好医院，北京 100029）

超高效液相色谱-飞行时间质谱联用分析清热凉血方中的化学成分*

鹿见香1赵 铁2曾伟贤1马雪婷1吕景晶1白彦萍2△

（1.北京中医药大学，北京 100029；2.中日友好医院，北京 100029）

目的鉴定中药复方清热凉血方浸膏中成分，为其治疗银屑病的物质基础提供科学依据。方法采用超高效液相色谱-飞行时间质谱联用（LC-ESI-QTOF MS）仪分析。色谱柱：5 cm×2.1 mm，1.7 μm BEH C18柱，流动相为0.1％的甲酸溶液（A）-0.1％乙腈溶液（B），流速为0.3 mL/min。采用负离子模式与方中主要的单味药对比判断色谱峰的来源药材，继而通过与来源药材化学成分进行精确分子量的对比鉴定化合物。结果 样本中检测出30多种物质，共鉴定出22个中药成分，分别为柠檬酸/异柠檬酸（1）、没食子酸（2）、Mudanoside B（3）、儿茶素（6）、羟基芍药苷（7）、短叶苏木酚酸（8）、丹皮酚（10）、牡丹酚新苷（12）、白芍苷 R1 （13）、芍药苷（14）、鞣花酸（15）、没食子酰芍药苷（16）、五没食子酰葡萄糖苷（17）、Oldenlandoside I（18）、苯甲酰氧芍药苷（19）、牡丹皮苷C（20）、苯甲酰芍药苷（24）、三羟基-十八碳二烯酸（25）、Anguivioside B1/2（26）、三羟基-十八碳二烯酸/9-羟基十八烷二酸（29）、2-羟基-3-甲基蒽醌（30）。结论在清热凉血方主要化学成分中，丹皮酚、芍药苷、白芍苷R1与银屑病的发病机理相关，可能是其活性成分。

清热凉血方 银屑病 超高效液相色谱-飞行时间质谱（LC-ESI-QTOF MS） 化学成分

清热凉血方（又名祛银颗粒）是本文通信作者白彦萍教授根据中医理论结合银屑病（血热型）的特点和现代药理学研究的自拟方药。该方以犀角地黄汤为基础加减而成，清热凉血解毒中药为其主要成分，其良好的临床疗效已通过前期的临床及动物模型研究得到证实［1］。为揭示清热凉血方的临床疗效物质基础，为其安全有效应用提供科学依据，本研究采用超高效液相色谱-飞行时间质谱联用（LC-ESI-QTOF MS）技术，利用超高效液相色谱优良的分离效能，结合飞行时间质谱提供的准确分子量，对这一制剂中的化学成分进行全面的分析。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 仪器 超高效液相色谱-飞行时间质谱联用仪［美国Waters公司Acquity超高效液相色谱系统、高压二元梯度泵（Binary Solvent Manger）、恒温自动进样器（SampleManger）、柱温箱、电喷雾离子源（ESI）、四级杆飞行时间质谱仪（Bruker公司QTOF-MS）、Hystar工作站］。色谱柱：5 cm×2.1mm，1.7μm BEHC18柱（Waters，USA）。工作站为MassLynx V4.1软件（美国Waters公司）

1.2 药物与试剂 清热凉血方组方为土茯苓、生地黄、赤芍、牡丹皮、白花蛇舌草等；所有药材均经主管中药师鉴定。标准品：没食子酸（批号0831-9501）、儿茶素（批号877-200001）、丹皮酚（批号0708-9704）均购买自中国生物制品检定所，纯度为98％。高效液相色谱-梯度甲酸购买CNW公司（Dusseldorf，Germany）。甲醇、乙腈 （色谱纯，购买于Fisher公司），MilliQ水由Elix纯水系统及Millipak-20 Filter Unit处理。

1.3 色谱条件 高效液相色谱柱（Waters，USA）色谱柱为 5 cm×2.1 mm，1.7 μm BEH C18色谱柱 （Waters，USA），柱恒温40℃，以超纯水与0.1％甲酸铵为A相，乙腈为B相。按如下设置进行梯度洗脱：0～3 min，5％～50％B；3～10 min，50％～70％B；10～15 min，70％～100％ B，100％B保持5 min。流速0.3 mL/min。4℃自动进样1μL。色谱分析在WatersACQUITYUPLC系统上进行。

1.4 质谱条件 采用电喷雾离子源（ESI）模式（负离子电压2.5 kV、正离子3 kV），离子源温度110℃，锥形流速为30 L/h，脱溶剂气流速600 L/h，加热毛细管温度300℃。锥孔电压40 V。质谱分析在动态范围扩展W光学模式12000分辨率。用浓度2μg/mL、流速20μL/min亮氨酸脑啡肽作为质量数、喷射频率10 s，正负离子质量的扫描范围均为50～2000 m/z。

1.5 样品处理 清热凉血方中各药味均各取50 g加10倍体积清水煎煮2次，合并水煎液加水稀释，12000转/min，离心5 min，所得上清液经0.22 μm滤膜过滤后取1 μL进行UPLC-ESI-QTOF MS分析。

2 结果

2.1 鉴定清热凉血方中成分 清热凉血方主要组成药材典型总离子流（TIC）色谱图复方样本的正、负极模式见图1。由图1可见负离子模式下检测到的化学成分比正离子模式下物质多，提示本复方中可能含有较多的有机酸。UPLC-QTOFMS分析复方样本中检测到超过30种相对较多物质。其中22种物质根据其保留时间、文献数据准分子离子精确m/z和功能片段鉴定为柠檬酸/异柠檬酸（1）、没食子酸（2）、Mudanoside B（3）、儿茶素（6）、羟基芍药苷（7）、短叶苏木酚酸（8）、丹皮酚（10）、牡丹酚新苷（12）、白芍苷 R1（13）、芍药苷（14）、鞣花酸（15）、没食子酰芍药苷（16）、五没食子酰葡萄糖苷（17）、Oldenlandoside I（18）、苯甲酰氧芍药苷（19）、牡丹皮苷C（20）、苯甲酰芍药苷（24）、三羟基-十八碳二烯酸（25）、Anguivioside B1/2（26）、三羟基-十八碳二烯酸/9-羟基十八烷二酸（29）、2-羟基-3-甲基蒽醌（30）。部分化学结构展示在图2中。

图1 正负离子模式下汤剂成分的总离子图

图2 清热凉血方部分成分的化学结构式

2.2 清热凉血方中成分化学式的鉴定 对制剂中色谱峰的鉴别主要依据精确分子量及来源药材进行。具体方法如下：首先，根据［M-H］-/［M-H+Cl］-/［2M-H］-阴极和/或［M+H］+/［M+NH4］+/［M+Na］+在阳极离子峰。在此步骤中，样本成分响应值较高负极应用的较多。第2步，计算各成分精确的化学式，例如可接受的精确阈值、氮原子数量的通常规则、DBE指数、显示同位素功能。第3步，根据化学式查询天然产品字典、化学目录等化学数据库。通过检索数据库Dictionary of Natural Products中对应药材的化学成分，将待鉴定色谱峰的精确分子量及分子式与数据库中记载的化学成分精确分子量及分子式进行匹配，从而对色谱峰进行鉴别。同时，文献中报道与碎片离子相吻合。丹皮酚、没食子酸、儿茶素、芍药苷等通过与标准品的保留时间和质谱碎片比对确定。结果见表1。

3 结论

中药清热凉血方在临床上治疗银屑病效果良好［1］。本研究利用LC-ESI-QTOF MS系统的高分离度及精确分子量信息，并结合色谱峰药材来源的分析与药材化学成分数据库的检索，达到了对制剂中主要成分的有效分析和鉴别［2-3］，LC-ESI-QTOF MS技术能够以质谱碎片信息推定化合物结构，此优势成为中药等复杂体系成分分离分析及化合物结构鉴定的主要方法［4］。本研究应用此方法研究了清热凉血方的化学成分。首次初步检测到超过30种化合物，确定了22个，为今后清热凉血方的质量控制、稳定其疗效、阐明其作用的物质基础提供了科学依据。

银屑病的发病特征为角朊细胞增殖和分化异常，伴随显著的炎症反应。传统筛选抗银屑病药的疗效目标主要集中在抗增殖、促分化和抗炎症3个方面。在本研究中鉴定的成分中，已有研究表明从白芍中提取的有效组分白芍总苷（TGP）具有双向免疫调节作用，并具有抗炎、镇静、镇痛、抗病毒等多种药理作用［5］。白芍苷RI（AR1）是从白芍中提取出的一种新的单枯苷类化合物，白芍苷R对J774巨噬细胞的增殖表现出较强的抑制作用［6］。白芍苷R1对HeLa细胞、K562两种癌细胞株的增殖也表现出一定的抑制作用。丹皮酚作为牡丹皮的主要药用成分，具有镇静、催眠、抗菌、抗炎、抗氧化、降血压、抗过敏、抗病毒等作用［7-9］，丹皮酚制成的软膏临床上具有治疗皮肤病的良好疗效［10-12］，丹皮酚软膏可降低毛细血管通透性，抑制炎症，对Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型变态反应均有抑制作用［13］；其对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和大肠埃希菌抑菌作用最强，其次是伤寒杆菌和乙型副伤寒杆菌，对变形杆菌作用较弱［14］；牡丹皮水提物和醇提物都有一定的抑菌作用，水提物抑菌作用较醇提物强［15］，从侧面证明其对银屑病的炎症部分的作用。本实验结果显示，清热凉血方中的成分复杂，各成分的相互作用，可以多方面达到治疗目的，从而显示出中药复方多靶点治疗疾病的优势。

本结果为进一步开展细胞和分子生物学实验探讨清热凉血方作用分子机制提供线索，也为清热凉血方处方优化和质量标准的建立提供参考。值得注意的是，面对清热凉血方中的复杂的化学成分，本研究显然是远远不够的，需要进一步对未知更多的化学成分进行分析鉴别。

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Chem ical Constituents of Heat-clearing and Blood-cooling Decoction Analysed by LC-ESI-QTOF MS

LU Jian-xiang，ZHAO Tie，ZENG Wei-xian，et al. Beijing University of Traditional Chinese Medicine，Beijing 100029，China

Objective：To identify non-target compounds in heat-clearing and blood-cooling Decoction samples and to provide scientific basis for Heat-clearing and blood-cooling Decoction treating psoriasis.M ethods：Ultra Performance Liquid Chromatography system equipped with a 5 cm×2.1 mm，1.7 μm BEH C18column was used in this study.The column，constant at 40℃，was eluted with a linear gradient of 5％～50％B over 0～3 min，50％～70％B over 3～10 min，70％～100％B over 10～15 min，the composition was held at 100％B for 5 min，where A= water with 0.1％ammonium formate and B=acetonitrile.The flow rate was 0.3 mL/min.Injection volume was 1 μL for both positive ion mode（ES+）and negative ion mode（ES-）.The mass spectrometric data of full scan mode was collected by using a Xevo G2 QT of MS.Results：More than 30 components were detected with relatively high abundance from the soup sample by UPLC-QTOFMS analysis.Among them，22 components were identified as citric acid（1），gallic acid（2），mudanoside B（3），catechin（6），oxypaeoniflorin（7），brevifolin carboxylic acid（8），paeonol（10），apiopaeonoside（12），albiflorin R1（13），paeoniflorin（14），ellagic acid（15），galloylpaeoniflorin（16），pentagalloyl glucose（17），oldenlandoside I（18），benzoyloxypaeoniflorin（19），mudanpioside C（20），benzoylpaeoniflorin（24），trihydroxy-octadecadienoic acid（25），anguivioside B1/2（26），trihydroxy-octadecenoic acid/9-Hydroxyoctadecanedioic acid（27），trihydroxy-octadecenoic acid/9-hydroxyoctadecanedioic acid（29），and 2-hydroxy-3-methylanthraquinone（30）.Conclusion：Paeonol，paeoniflorin and albiflorin R1 may contribute to heat-clearing and blood-cooling Decoction.

Heat-clearing and blood-cooling Decoction；Psoriasis；LC-ESI-QTOF MS；Chemicals

R287

A

1004-745X（2014）04-0565-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2014.04.001

国家自然科学基金资助项目（No.81173270）；北京市自然科学基金资助项目（No.7112122）

△通信作者

表1 清热凉血方部分成分鉴定结果

2013-11-21）