高效液相色谱法测定土霉素片的含量

乔晓芳

（河南省安阳市食品药品检验所，河南 安阳 455000）

高效液相色谱法测定土霉素片的含量

乔晓芳

（河南省安阳市食品药品检验所，河南 安阳 455000）

目的建立土霉素片的含量测定方法。方法高效液相色谱法。采用Luna-C18色谱柱，以0.05 mol/L草酸铵溶液-二甲基甲酰胺-0.2 mol/L磷酸氢二铵（70∶25∶5）为流动相，用紫外检测器在282 nm波长处检测。结果土霉素片浓度在0.01～1 mg/mL范围内与峰面积线性关系良好（r＝0.9990），平均回收率为100.1%。结论高效液相色谱法快速、简便、准确，可用于土霉素片的含量测定。

土霉素片；含量测定；高效液相色谱法；抗生素微生物检定法

土霉素为四环素类抗生素。本品为广谱抑菌剂。土霉素作用机制为药物能特异性地与细菌核糖体30S亚基的A位置结合，抑制肽链的增长和影响细菌蛋白质的合成。用于痢疾、沙眼、结膜炎、肺炎、中耳炎、皮肤化脓感染等。亦用于治疗阿米巴肠炎及肠道感染。土霉素片收载于卫生部药品标准抗生素分册，其含量测定方法是用抗生素微生物检定法二剂量法，方法步骤繁琐，培养时间长[1]。现采用HPLC法，方法简便、灵敏、准确。

1 仪器与试药

日本岛津LC-2010型高效液相色谱仪（自动进样器，四元泵，紫外检测器）；抑菌圈自动测量仪CAM-III。

土霉素对照品（批号：130487-200702，含量为93.6% 中国药品生物制品检定所），土霉素片（宜昌人福药业有限责任公司，批号20130107 20121203石家庄市协和药业公司批号20130607）；磷酸氢二铵、草酸铵，二甲基甲酰胺、盐酸均为分析纯，水为超纯水，空白样品（是指不含土霉素，其余辅料按制剂压片）自配。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

WH-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：0.05 mol/L草酸铵溶液-二甲基甲酰胺-0.2 mol/L磷酸氢二铵（70∶25∶5）；流速：0.9 mL/min，柱温：30 ℃，检测波长：282 nm：进样量：20 μL[1]。

2.2 溶液制备

对照品溶液：精密称取土霉素对照品约25 mg置25 mL量瓶中，加0.1 mol/L盐酸溶液5 mL使溶解后，再加水至刻度，摇匀，制成每l mL含土霉素l mg的溶液，精密量取5 mL置50 mL量瓶中，再用0.01 mol/L盐酸溶液稀释至每l mL含土霉素0.1 mg的溶液。

供试品溶液：土霉素片（0.25克/片）取20片精密称定重量，精密称取适量（约相当于土霉素25 mg）置25 mL量瓶中，加0.1 mol/L盐酸溶液5 mL使溶解后，再加水，摇匀，滤过，精密量取续滤液5 mL置50 mL量瓶中，加0.01 mol/L盐酸溶液稀释至刻度，摇匀即得每l mL含土霉素0.1 mg的溶液。

2.3 系统适应性试验

精密称取土霉素对照品约25 mg置25 mL量瓶中，加0.1 mol/L盐酸溶液5 mL使溶解后，再加水至刻度，摇匀，制成每l mL含土霉素l mg的溶液，精密量取5 mL置50 mL量瓶中，再用0.01 mol/L盐酸溶液稀释至每l mL含土霉素0.1 mg的溶液，摇匀。在上述色谱条件下，取上述20 μL自动进样（图1），计算柱效为6478，分离度符合要求，连续进样5次，峰面积的RSD＝0.48%。

2.4 空白干扰试验

取空白样品（是指不含土霉素，其余辅料按制剂压片）按测定方法依法操作，取20 μL自动进样，记录色谱图，未见杂质峰（图2）。

2.5 线性关系考察

取上述土霉素对照品溶液（1.0 mg/mL），分别用0.01 mol/LHCL配制成0.01、0.025、0.050 、0.075、0.10、0.50、0.75、0.25 mg/mL，共9个浓度系列对照品溶液，分别精密吸取上述对照品溶液各20 μL注入色谱仪自动进样，按拟定色谱条件测定。得各浓度峰面积，以峰面积为纵座标，浓度为横坐标绘制标准曲线，得回归方程：Y＝-2.10636 ×10-3+2.0635×10-9X （r＝0.9999）。结果表明，土霉素片浓度在0.01～1 mg/mL范围内与峰面积线性关系良好。

2.6 加样回收试验

分别精密量取对照品溶液（1 mg/mL）5.00、3.75、2.50 mL置50 mL量瓶中，各加入处方比例量的空白样品，用0.01 mol/L HCL稀释至刻度，摇匀，过滤，得0.1、0.075、0.05 mg/mL的溶液，按测定方法依法测定，自动进样20 μL，计算结果见表1。

表1 HPLC法测定土霉素片回收实验结果（n=3）

图1 对照品溶液HPLC

2.7 稳定性实验

取0.1 mg/mL对照品溶液重复进样5次，每次20 μL，峰面积的RSD＝0.48%。上述同一份溶液于0、2、4、6、8 h分别进样20 μL，测定土霉素峰面积，结果RSD＝1.2% n＝5）。

2.8 样品测定

取土霉素片按上述含量测定方法及抗生素微生物法测定法[2]，结果见表2。

表2 样品测定HPLC法与微生物法结果比（n=3）

3 讨 论

3.1 色谱柱、流动相及检测波长，参考盐酸土霉素含量测定方法。使用C18柱和上述流动相，均有较理想的分离效果及适当的保留时间，测定波长选在282 nm也有满意的吸收值。本实验使用进口WH-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）柱效果更理想。

图2 辅料溶液HPLC

3.2 线性关系考察

取土霉素对照品配制的0.01～1 mg/mL的9个浓度系列的溶液，测得各点的平均峰面积，并以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线，求得回归方程Y＝-2.10636×10-3+2.0635×10-9X，相关系数r为0.9999表明土霉素在0.01～1 mg/mL的浓度范围内有良好的线性关系。

3.3 空白干扰试验：可看出空白样品在土霉素峰保留时间处（约10 min）无明显杂峰干扰。

3.4 加样回收率试验：从表1数据可说明本方法有较好的回收率100.1%。

3.5 稳定性试验，表明本法重复性较好RSD＝0.48%，溶液在8h内稳定，能满足测定的要求。

3.6 高效液相色谱法与微生物法比较，从表2数据表明HPLC法与抗生素微生物法结果近似，HPLC法完全可以取代抗生素微生物检定法。用于土霉素片的含量测定[3]。

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典(二部)[S].北京:化学工业出版社,2005:462-463.

[2] 中华人民共和国卫生部.药品标准(抗生素药品第一册)[S].1989.

[3] 杨开金.紫外分光光度法与抗生素微生物检定法测定土霉素含量方法比较[J].中国基层医药,2006,13(7):131.

Determination of the Content of Oxytetracycline Tablets by HPLC

QIAO Xiao-fang
(Anyang Institute for Food and Drug Control, Anyang 455000, China)

ObjectiveTo establish a method for determination of the content of Oxytetracycline tablets.MethodsHigh performance liquid chromatography. The WH-C18column, with 0.05 mol/L ammonium oxalate solution - two methyl formamide -0.2 mol/L diammonium hydrogen phosphate (70∶25∶5)as mobile phase, using a UV detector at 282 nm wavelength.ResultsOxytetracycline Tablets concentration relationship in 0.01-1 mg/mL scope with the peak area of linear(r= 0.9990), the average recovery rate was 100.1%.ConclusionThe HPLC method is rapid, simple and accurate, can be used for the content determination of Oxytetracycline tablets.

Oxytetracycline tablets; Content determination; HPLC; Microbiological method

R927.2

B

1671-8194（2014）21-0080-02