水体铜胁迫对克氏原螯虾血淋巴ROS和血蓝蛋白含量的影响

赵辉　魏克强

摘 要：在测得Cu2+致克氏原螯虾96 h LC50的质量分数为30 mg/L的基础上，将螯虾分别暴露于质量分数为0 mg/L、0.5 mg/L、1.0 mg/L、3.0 mg/L、5.0 mg/L、10.0 mg/L的Cu2+溶液中，在暴露24 h、48 h、72 h和96 h后，测定血淋巴ROS和血蓝蛋白含量。结果表明，螯虾血淋巴ROS含量呈现先被诱导上升后被抑制的趋势，Cu2+具有能够抑制螯虾血淋巴细胞产生活性氧ROS的能力；血清血蓝蛋白含量先上升而后逐渐趋于稳定，最后显著上升。

关键词：铜离子（Cu2+）；克氏原螯虾；ROS；血蓝蛋白

中图分类号：X174 文献标识码：A 文章编号：2095-6835（2014）04-0103-02

甲壳动物的免疫防御为非特异性免疫，缺乏高等动植物的特异性免疫功能，利用活性氧作为杀伤分子的氧化性杀菌机制是甲壳动物一种主要的防御机制，它主要指吞噬细胞在吞噬异物或者受刺激活化呼吸爆发产生大量的活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS），这个过程就是呼吸爆发。研究表明，机体活性氧产生的强弱程度直接反映了血细胞杀菌功能的强弱。血蓝蛋白是生物体内的一种多功能蛋白，甲壳动物血蓝蛋白约占血淋巴蛋白的90%以上。作为一种呼吸蛋白，血蓝蛋白除载氧外还具有酚氧化物酶活性、抗菌肽活性和凝集活性等功能，此外血蓝蛋白还具有转运金属离子、能量储存等功能。

本实验以克氏原螯虾为研究对象，测定了Cu2+胁迫下螯虾血细胞呼吸爆发后血淋巴ROS含量和血淋巴血蓝蛋白含量的变化，探讨Cu2+对克氏原螯虾血淋巴ROS和血蓝蛋白含量的影响，从而为水产品的安全养殖提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

克氏原螯虾（Procambarus clarkii），购于太原市五龙口水产批发市场，体重（20.1±0.5）g，体长（8.7±0.3）cm。实验前在40 cm×30 cm×20 cm 的玻璃水族箱中驯养1周，驯养水为曝气2 d以上的自来水，每天不间断曝气，每天投放饲料1次，定时换水，实验前1 d停止喂食。

Cu2+溶液用硫酸铜配制（CuSO4·5H2O，分析纯，天津市登峰化学试剂厂），实验前用蒸馏水将CuSO4·5H2O配成质量浓度为10 g/L的母液备用。二氯荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）购于sigma公司，二甲基亚砜（DMSO）购于北京索莱宝科技有限公司。

1.2 染毒方法

根据急性毒性实验结果，Cu2+致克氏原螯虾96 h LC50的质量浓度为30 mg/L，实验设5个质量浓度梯度组（质量浓度分别为0.5 mg/L、1.0 mg/L、3.0 mg/L、5.0 mg/L、10.0 mg/L）和一个对照组（质量浓度为0 mg/L），处理时间为96 h。采用体外暴露的方法对克氏原螯虾进行Cu2+染毒，每个处理组15只。整个试验阶段停止喂食，水温14～16 ℃。

1.3 采样及样品处理

暴露24 h、48 h、72 h、96 h后分别从对照组和处理组中随机取出3尾螯虾，采集血淋巴，用1 mL注射器从螯虾围心腔采血，制成抗凝血（抗凝剂∶血=1∶1），其中一部分用于血淋巴ROS含量的测定，另一部分抗凝血制备成血清，在温度为4 ℃的条件下，5 000 r/ min离心10 min，取出的上清液于-20 ℃的条件下保存，用于血蓝蛋白的测定。

1.4 血淋巴ROS含量测定

血淋巴ROS的测定按照细胞活性氧（ROS）试剂盒说明书进行，组织ROS利用DCFH-DA荧光探针进行检测，取抗凝血190 μL和10 μL物质的量浓度为0.1 mmol/L的DCFH-DA溶液加入96孔黑色酶标板中，混匀，置于酶标仪中37 ℃保温。30 min后于激发波长485 nm，在发射波长538 nm的条件下检测荧光强度，结果以突光强度/毫克蛋白表示。

1.5 血清血蓝蛋白含量测定

2 结果与分析

2.1 不同浓度Cu2+暴露对螯虾血淋巴ROS含量的影响

不同浓度Cu2+胁迫下螯虾血淋巴ROS含量随时间的变化如图1所示，经硫酸铜处理24 h后，Cu2+质量浓度为3.0 mg/L时，ROS含量达到最大值。与对照组相比极显著升高（P<0.01），Cu2+质量浓度为5.0 mg/L，与对照组相比ROS含量显著升高（P<0.05），其余处理组与对照组相比无显著差异；铜暴露48 h、72 h和96 h后，随着Cu2+质量浓度的升高，ROS含量逐渐下降。铜暴露48 h后，Cu2+质量浓度为1.0 mg/L和10.0 mg/L，ROS含量与对照组相比极显著降低（P<0.01），质量浓度为0.5 mg/L的处理组ROS含量与对照组相比显著降低（P<0.05），其余处理组与对照组相比无显著差异。铜暴露72 h后，当Cu2+质量浓度为0.5 mg/L、5.0 mg/L和10.0 mg/L时，ROS含量与对照组相比显著降低（P<0.05），其余处理组与对照组相比无显著差异。铜暴露96 h后，各处理组ROS含量均低于对照组，但与对照组相比无显著差异（P>0.05）。

3 讨论

3.1 Cu2+胁迫对螯虾血淋巴ROS含量的影响

重金属等环境污染物进入生物体内，能够引起机体一系列的生理生化反应，对于没有特异性免疫功能的甲壳动物来说，吞噬作用在机体的防御机制中起着举足轻重的作用。血细胞吞噬作用的主要机制之一就是伴随着呼吸爆发产生大量的活性氧ROS，从而导致机体的氧化损伤。实验结果表明，在Cu2+暴露24 h后，螯虾血淋巴ROS含量显著升高，3.0 mg/L的处理组表现为极显著升高。48～72 h期间，所有处理组的ROS含量均显著下降，低于对照组的含量。染毒96 h后，螯虾血淋巴ROS含量逐渐趋于稳定，各处理组ROS含量低于对照组，但与对照组相比无显著差异。王宝杰等的研究明，Cu2+对对虾血细胞产生活性氧ROS的能力具有不同程度的抑制作用，这与本实验研究结果相符。张峰等的研究表明，重金属能够抑制皱纹盘鲍血细胞吞噬活动中的活性氧（ROS）的产生，而且这种抑制作用随着重金属浓度的增加而加强。

3.2 Cu2+胁迫对螯虾血清血蓝蛋白含量的影响

血蓝蛋白是甲壳动物血淋巴中一种含铜的呼吸蛋白，脱氧状态为无色，结合氧状态为蓝色，其含量容易受到各种因素的影响，比如温度、pH值、机体状态和其他环境因子等。Cu2+暴露24 h后，各处理组的血蓝蛋白含量均高于对照组；暴露48 h时，各组的血蓝蛋白含量趋于稳定，暴露72 h和96 h后，血蓝蛋白含量显著上升。张亚娟等研究表明，日本沼虾在受到环境因素的胁迫后，血蓝蛋白含量显著升高，与本实验得出的结果一致。中华绒鳌蟹在从淡水过渡到咸水中时，血蓝蛋白的含量也会发生显著的变化。

参考文献

[1]孙敬锋，吴信忠.贝类血细胞及其免疫功能研究进展[J].水生生物学报，2006，30（5）：601-607.

[2]Horan T D，English D，Mcpherson T A. Association of neutrophil chemiluminescence with microbicidal activity[J].Clinical Immunology and Immunopathology，1982，22（2）：259-269.

[3]Djangmah J S. The effect of feeding and starvation on copper in the blood and hepatopancreas and on blood protein of Crangon vulgaris （Fabricius）[J].Comp Biochem Physiol，1970，32：709-731.

[4]曹侦，冯广朋，庄平，等.长江口中华绒螯蟹放流亲蟹对环境的生理适应[J].水生生物学报，2013，37（1）：34-41.

[5]Chen J C，Cheng S Y.Hemolymph oxygen content， oxy-hemocyanin，protein levels and ammonia excretion in the shrimp penaeus monodon exposed to ambient nitrite[J].Journal of Comparative Physiology，1995，164（7）：53 0-535.

[6]王宝杰，王雷.中国对虾血细胞吞噬活动中超氧阴离子的产生[J].中国水产科学，2003，10（1）：14-18.

[7]张峰，李光友.几种重金属对皱纹盘鲍血细活性氧产生的影响[J].海洋环境科学，2005，24（1）：32-34.

[8]张亚娟，刘存歧，王军霞，等.氨态氮和亚硝态氮对日本沼虾血细胞数量及血蓝蛋白含量的影响[J].四川动物，2008，27（5）：853-854.

[9]王顺昌，许立.不同盐度下中华绒鳌蟹血清总蛋白和血蓝蛋白含量的变化[J].淮南师范学院学报，2003，5（19）：24-26.

〔编辑：陈文强〕

Abstract： Measured Cu2 +-induced Procambarus shrimp 96 h LC50 mass fraction of 30 mg / base L， based on the crayfish were exposed to the mass fraction of 0 mg / L， 0.5 mg / L， 1.0 mg / L， 3.0 mg / L， 5.0 mg / L， 10.0 mg / L of Cu2 + solution， exposed 24 h， 48 h， 72 h and 96 h after the determination of ROS and hemolymph hemocyanin content. The results showed that crayfish hemolymph was induced ROS levels rise after first showing inhibition trend， Cu2 + has the ability to be able to suppress the crayfish blood lymphocytes of reactive oxygen species ROS； serum hemocyanin increased first and then gradually stabilized， finally increased significantly.

Key words： copper ions（Cu2 +）； procambarus shrimp； ROS； hemocyanin

3.2 Cu2+胁迫对螯虾血清血蓝蛋白含量的影响

血蓝蛋白是甲壳动物血淋巴中一种含铜的呼吸蛋白，脱氧状态为无色，结合氧状态为蓝色，其含量容易受到各种因素的影响，比如温度、pH值、机体状态和其他环境因子等。Cu2+暴露24 h后，各处理组的血蓝蛋白含量均高于对照组；暴露48 h时，各组的血蓝蛋白含量趋于稳定，暴露72 h和96 h后，血蓝蛋白含量显著上升。张亚娟等研究表明，日本沼虾在受到环境因素的胁迫后，血蓝蛋白含量显著升高，与本实验得出的结果一致。中华绒鳌蟹在从淡水过渡到咸水中时，血蓝蛋白的含量也会发生显著的变化。

参考文献

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[3]Djangmah J S. The effect of feeding and starvation on copper in the blood and hepatopancreas and on blood protein of Crangon vulgaris （Fabricius）[J].Comp Biochem Physiol，1970，32：709-731.

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[8]张亚娟，刘存歧，王军霞，等.氨态氮和亚硝态氮对日本沼虾血细胞数量及血蓝蛋白含量的影响[J].四川动物，2008，27（5）：853-854.

[9]王顺昌，许立.不同盐度下中华绒鳌蟹血清总蛋白和血蓝蛋白含量的变化[J].淮南师范学院学报，2003，5（19）：24-26.

〔编辑：陈文强〕

Abstract： Measured Cu2 +-induced Procambarus shrimp 96 h LC50 mass fraction of 30 mg / base L， based on the crayfish were exposed to the mass fraction of 0 mg / L， 0.5 mg / L， 1.0 mg / L， 3.0 mg / L， 5.0 mg / L， 10.0 mg / L of Cu2 + solution， exposed 24 h， 48 h， 72 h and 96 h after the determination of ROS and hemolymph hemocyanin content. The results showed that crayfish hemolymph was induced ROS levels rise after first showing inhibition trend， Cu2 + has the ability to be able to suppress the crayfish blood lymphocytes of reactive oxygen species ROS； serum hemocyanin increased first and then gradually stabilized， finally increased significantly.

Key words： copper ions（Cu2 +）； procambarus shrimp； ROS； hemocyanin

3.2 Cu2+胁迫对螯虾血清血蓝蛋白含量的影响

血蓝蛋白是甲壳动物血淋巴中一种含铜的呼吸蛋白，脱氧状态为无色，结合氧状态为蓝色，其含量容易受到各种因素的影响，比如温度、pH值、机体状态和其他环境因子等。Cu2+暴露24 h后，各处理组的血蓝蛋白含量均高于对照组；暴露48 h时，各组的血蓝蛋白含量趋于稳定，暴露72 h和96 h后，血蓝蛋白含量显著上升。张亚娟等研究表明，日本沼虾在受到环境因素的胁迫后，血蓝蛋白含量显著升高，与本实验得出的结果一致。中华绒鳌蟹在从淡水过渡到咸水中时，血蓝蛋白的含量也会发生显著的变化。

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[9]王顺昌，许立.不同盐度下中华绒鳌蟹血清总蛋白和血蓝蛋白含量的变化[J].淮南师范学院学报，2003，5（19）：24-26.

〔编辑：陈文强〕

Abstract： Measured Cu2 +-induced Procambarus shrimp 96 h LC50 mass fraction of 30 mg / base L， based on the crayfish were exposed to the mass fraction of 0 mg / L， 0.5 mg / L， 1.0 mg / L， 3.0 mg / L， 5.0 mg / L， 10.0 mg / L of Cu2 + solution， exposed 24 h， 48 h， 72 h and 96 h after the determination of ROS and hemolymph hemocyanin content. The results showed that crayfish hemolymph was induced ROS levels rise after first showing inhibition trend， Cu2 + has the ability to be able to suppress the crayfish blood lymphocytes of reactive oxygen species ROS； serum hemocyanin increased first and then gradually stabilized， finally increased significantly.

Key words： copper ions（Cu2 +）； procambarus shrimp； ROS； hemocyanin