正交试验优化超声辅助提取大花红景天多糖工艺

周凌云，周 建，阮文懿，王朝清，孙 玉

(1.皖南医学院 药学院，安徽 芜湖 241002；2.无为县人民医院，安徽 无为238300)

大花红景天Rhodiolacrenulata(HK.f.et Thoms.) H.Ohba系景天科红景天属多年生药食两用草本植物.研究表明，红景天具有强身、抗缺氧、抗衰老、抗疲劳、抗肿瘤、抗微波辐射及兴奋大脑和脊髓的作用[1-2].国内外对于大花红景天多糖提取方法通常采用热水提取[3]，需要较长的时间和较多的能耗.随着科学的发展，更多的提取手段被用在植物化学成分提取方面.对于本属其它植物的多糖成分利用新的手段进行提取也有报道[4-5]，但对于大花红景天利用超声波辅助提取优化工艺方法未见报道.本研究通过单因素实验和正交设计方法，对于大花红景天的微波辅助提取方法进行了系统的研究，比较了超声波提取方法和传统热水提取方法在多糖得率上的差异，并考察了提取工艺对多糖破坏程度.

1 材料与方法

1.1 仪器与材料

仪器:KH-400DB型超声数控清洗器(昆山禾创超声仪器有限公司)；UV-5100型紫外可见分光光度计(上海元析仪器有限公司)；FA-2400型电子天平(上海良平仪器仪表有限公司)；SHZ-III循环水真空泵(上海亚荣生化仪器厂)；旋转蒸发仪(heidolph laborota 4003)；DZF-6050 型真空干燥箱(上海精宏实验设备有限公司).

材料:大花红景天根茎(青海西宁唐古风商贸有限公司提供，经皖南医学院药学院包淑云副教授鉴定为大花红景天，留样于药物化学教研室)；其余试剂均购于上海国药集团，均为分析纯.

1.2 方法

(1)红景天多糖含量测定方法的建立.参照黄家锟等人测定红景天多糖的方法，同法操作，以吸光度A对葡萄糖浓度C进行线性回归，得回归方程为：A=0.0168C+0.0342(r=0.9998).实验表明，葡萄糖在5～60ug/mL范围呈良好的线性关系.

(2)加样回收试验.分别吸取葡萄糖对照品溶液6份，置已知含量的供试品溶液中，按1.2(1)条件测定.测得平均回收率为99.39%，RSD为0.81%，说明用苯酚-硫酸法测定大花红景天中多糖含量的准确度较高.

(3)提取工艺对多糖破坏程度方法的建立.①参照3,5-二硝基水杨酸比色法(DNS比色法)，以葡萄糖为标准品，绘制标准曲线，得标准曲线方程为A=0.0165C+0.0459(r=0.9997).通过酸水解多糖提取物，利用总糖质量浓度减去游离单糖质量浓度，计算出多糖得率，可判断提取工艺对多糖的破坏程度.②根据单糖及多糖在80%乙醇溶解度的差异，将粗多糖用优化后的方法进行提取，提取物用80%乙醇回流1h，滤渣干燥.在相同取样量和相同分析条件下，比较粗多糖和处理后多糖的质量浓度，判断提取工艺对多糖的破坏程度.

2 实验过程及结果

2.1 红景天粉末的预处理

称取大花红景天粉100g，置500mL圆底烧瓶中，将此烧瓶放入加热回流提取装置中，依此用500mL石油醚回流提取2次，滤液除去，80%的乙醇回流提取2次，每次1h，最后将残渣放入60℃的真空干燥箱中烘干，备用.

2.2 传统水提取工艺

(1)水提取实验.根据黄家锟、宋学伟等人的正交设计法优化大花红景天多糖提取工艺的结论，取2g大花红景天粉末，以料液比1:12，温度80℃，提取时间为2h处理.将所得提取液浓缩干燥后，取样，用适量水溶解，定容到100mL, 利用苯酚-硫酸法测量吸光度值为0.1575，得多糖质量浓度为7.34ug/mL，多糖得率为10.29%.

(2)水提取工艺对多糖破坏程度实验.将2.2(1)剩余粗多糖分为A,B两组.A组利用DNS比色法，按1.2(3)①操作，得到多糖得率为10.13%，多糖得率与略低于2.2(1)中的10.29%，两者间的多糖得率差值Δ%=0.16%.B组利用80%乙醇回流，按1.2(3)②操作，测得吸光度值为0.1420，得多糖质量浓度为6.42ug/mL.多糖质量浓度低于2.2(1)中的7.34ug/mL，处理前后的质量浓度差值ΔC=0.92ug/mL.由A,B两组数据，我们可知在水提过程中，多糖结构遭到了一定程度的破坏.

2.3 超声波法提取工艺优化

(1)单因素实验.①超声提取的温度考察.精密称取等量的已处理过的红景天粉末6份，固定条件在料液比为1:20，时间为30min，提取液乙醇的体积分数为0%，分别控制温度在50、60、65、70、75、80℃各提取3次.考察温度对超声提取的影响，结果如图1所示.可以看出，温度的高低直接影响多糖的得率.当温度为65℃时，多糖得率最高，达到13.44%.因此，最佳超声温度为65℃.②超声提取的时间考察.精密称取等量的已处理过的红景天粉末 6份，固定条件在温度65℃，料液比为1:20，提取液中乙醇的体积分数为0%，分别控制时间在15、20、30、40、50、60min 各提取3次.考察时间对超声提取的影响，结果如图2所示.可以看出随着超声时间的延长，多糖得率略有提升后便开始下降.这可能是多糖引起的热量积聚或机械剪切作用导致多糖架构变化而损失.当超声时间为20min，多糖得率最高，达到14.77%.因此，最佳超声时间为20min.③提取液中乙醇的体积分数的考察.精密称取等量的已处理过的红景天粉末 6份，固定条件在料液比为1:20，时间为20min，温度为65℃，分别控制提取液中乙醇的体积分数为0%、5%、10%、15%、20%、25%各提取3次，考察提取液中乙醇的体积分数对超声提取的影响.结果如图3所示.

图1 温度对大花红景天多糖提取的影响

图2 时间对大花红景天多糖提取的影响

图3 乙醇的体积分数对大花红景天多糖提取的影响

图4 料液比对大花红景天多糖提取的影响

3种大孔吸附树脂 X-5，S-8，D101 的吸附与解吸实验表明，洗脱剂中适当增加乙醇的体积分数时，洗脱部分的吸光度和收率均较好，说明一定比例乙醇的存在可能提高多糖的溶解解吸能力.所以，将乙醇的体积分数对多糖溶解的影响作为单因素进行探讨.从图3可以看出，随乙醇的体积分数的增加，多糖得率先上升后下降，5%时，多糖得率最高，达到12.50%.因此，最佳乙醇的体积分数为5%.④超声提取的料液比考察.精密称取等量的已处理过的红景天粉末 6份，固定条件在时间为15min，温度为65℃，提取液中乙醇的体积分数为5%，分别控制料液比为1:8，1:10，1:15，1:20，1:25，1:30各提取3次，考察料液比对超声提取的影响，结果如图4.可以看出，液料比在1:8，1:25，1:30时，多糖得率的变化不大，但明显低于1:10，1:15，1:20.这是因为料液比太低，短时间内多糖的浸提就达到平衡，不利于多糖的进一步溶出.而若料液比太高，浓缩时间过长，容易造成多糖的破坏.而当料液比为1:15时，多糖得率高达20.31%.因此，料液比宜采用1:15.

(2)正交试验.选取各个因素中3个最佳水平安排正交实验，得到超声提取红景天多糖的最佳工艺条件为A1B2C2D2，即提取温度为65℃，料液比为1:15，提取时间为20min，提取液中乙醇的体积分数为0%.各个因素对提取结果的影响顺序为：料液比>乙醇的体积分数>提取温度>提取时间.如表1和表2所示.

表1 单因素水平表

表2 正交试验结果表

(3)验证实验.取已预处理过的大花红景天粉3份，均按照A3B1C1D2工艺条件进行提取，按照1.2(1)中的①项下公式计算多糖得率分别为 15.54%，15.50%，15.52%(RSD=0.13%)，3者均高于正交实验项下的任一条件下的评分，故验证该工艺即为大花红景天超声提取的最佳工艺.

2.4 提取工艺对多糖破坏程度实验

(1)3,5-二硝基水杨酸比色法(DNS比色法).将大花红景天粉末最佳工艺提取的粗多糖分为两组，一组用适量水溶解后酸水解作为总糖溶液，一组用适量水溶解后做单糖溶液，分别于DNS试剂反应后测吸光度值，计算出多糖得率为15.35%.本实验最佳正交条件的得率为15.48%，两者间多糖得率的差值Δ%=0.13%.此差值与2.2(2)中的A组的差值Δ%=0.16%相比，二者之间差别很小.

(2)80%乙醇回流提取.取等量大花红景天粉末，按最佳正交条件处理，将所得粗多糖取样按1.2(1)测定吸光度值为0.7217，得多糖质量浓度为40.92ug/mL.再将剩余粗多糖用80%乙醇80℃回流1h，过滤得滤渣，再次干燥后测吸光度值为0.7122，得多糖质量浓度为40.36ug/mL.处理前后多糖质量浓度差值ΔC=0.56ug/mL.该质量浓度差值与2.2(2)中B组的质量浓度差值ΔC=0.92ug/mL相比较，二者之间差别很小.

以上两组数据表明，上述两种提取方法对大花红景天多糖都有一定程度的破坏.相对传统水提法，超声波提取工艺造成的破坏程度更低.

3 讨论

超声波提取技术是利用超声波的机械粉碎和空化作用，加速浸提物从原料向溶剂的扩散速率，具有提取率高、不需要高温、能耗低、提取时间大大缩短等优点.本实验利用超声波对大花红景天多糖提取，并采用苯酚-硫酸法测定多糖得率.试验结果表明，超声提取大花红景天的最佳工艺条件是：乙醇的体积分数0%，温度65℃，超声时间20min，料液比1：15.由于多糖的不稳定性，各种手段在提取过程对大花红景天多糖都存在一定的破坏.相比传统水提法，超声提取时间短，相对破坏较低.同时，对比传统水提的多糖得率(10.29%)和超声波辅助提取的多糖得率(15.48%)，可知，超声波辅助提取极大提高了大花红景天多糖的提取率，在大花红景天多糖的提取上有良好的应用价值.

参考文献：

[1]宋月英,马玉珍,韩慧文,等.红景天属植物化学成分及药理作用的研究进展[J].中草药,2004,35(2)：235-237.

[2]宋学伟,韩泳平,唐晓丽,等.大花红景天挥发油的优化提取条件及过程动力学研究[J].华西药学杂志,2005,20(5):383-384.

[3]李成,杨长青,朱彩凤,等.红景天多糖提取工艺的研究[J].时珍国医药,2006,17(10):1995-1996.

[4]邱远金,丁旭,谭勇,等.正交试验法优化蔷薇红景天多糖的提取工艺[J].中国药业,2012,21(16):55-57.

[5]龚刚明,王化田,韩娜.超声波法提取红景天多糖[J].食品科学,2005,26(10):127-129.