小麦高分子量麦谷蛋白亚基基因Dx5的克隆与生物信息学分析＊

黄明亮，黄志刚，徐颖莹，刘 清，唐 蛟，李合松

(湖南农业大学植物激素与生长发育湖南省重点实验室，湖南 长沙 410128)

小麦是世界上重要的粮食作物。小麦籽粒中蛋白质的含量和质量是影响小麦品质的关键因素，直接关系到面团的特性和面包加工品质［1］。小麦籽粒蛋白质主要由清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和麦谷蛋白组成，其中后两种蛋白合称为贮藏蛋白，是面筋的主要成分，约占籽粒蛋白质的85%［2-4］。

根据分子量的大小，麦谷蛋白可分为高分子量麦谷蛋白亚基 (HMW-GS)和低分子量麦谷蛋白亚基 (LMW-GS)，其中HMW-GS约占小麦籽粒蛋白质总量的12%，其组成和质量直接影响小麦面粉的品质［5］。

HMW-GS中以5和10亚基对面粉的品质影响最大［6］，其两者的编码基因Dx5和Dy10共同存在及连锁表达对提高生面弹性和面包的烘烤质量尤为明显［7］，但传统的杂交育种手段难以同时获得Dx5与Dy10重组基因且稳定表达的小麦后代。然而采用遗传转化分子育种手段获得Dx5与Dy10基因表达的新型小麦种质资源已有成功的先例，如Altpeter等［8］将小麦HMW-GS的Dx5和Dy10基因转化燕麦，获得了总蛋白质含量、麦谷蛋白含量和聚合状麦谷蛋白含量显著增加的转基因材料。

济麦20是山东省农业科学院作物所培育的面包面条兼用型优质小麦品种［9］，其籽粒蛋白质含量高，经农业部谷物品质监督检验测试中心测定为17.02%(干基)。济麦20的HMW-GS为1、7+8和5+10优质亚基组合［10］，其中5+10亚基由 Glu-D1位点的Dx5和Dy10所编码［11］。本研究以优质小麦品种济麦20为材料，克隆HWM-GS基因Dx5，并对其序列及编码的蛋白质进行生物信息学分析，旨在为进一步采用遗传转化分子育种手段来获得Dx5和Dy10基因高表达的新型小麦种质资源和深入研究HMW-GS基因的表达调控机理及开展作物蛋白质品质的改良奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

试验所用济麦20的种子由河南大学尚富德教授提供。种子经催芽后置于人工气候箱中，25℃恒温培养15 d后用于提取基因组DNA。大肠杆菌DH5α由本实验室保存。DNA Marker、Taq DNA聚合酶、dNTP、凝胶回收试剂盒和pMD19-T载体试剂盒等购自TaKaRa公司。引物委托北京六合华大基因科技股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 基因组 DNA提取及 PCR扩增 采用CTAB法进行基因组 DNA提取［12］。PCR扩增引物为P1F:TATCATCACCCACAACACC和P1R:GCATGCCTAAGCACCAT;PCR反应体系:50 μL体系中包括1.25 U 的 Taq DNA 聚合酶，0.2 mmol·L-1的dNTP，引物各 50 μmol·L-1，模板 DNA 200 ～ 300 ng;PCR条件:94℃预变性5 min，然后以94℃变性30 s，50℃退火30 s和72℃延伸3 min进行30个循环，最后以72℃延伸5 min结束;扩增产物于0.8%的琼脂糖凝胶中进行电泳检测。

1.2.2 PCR产物的TA克隆与序列测定 PCR产物的凝胶回收按照说明书进行。连接反应按pMD19-T载体试剂盒说明书进行，利用热激法将连接后的载体转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。转化后的大肠杆菌经氨苄青霉素、X-Gal和IPTG平板筛选，挑取白色菌斑进行菌体PCR扩增鉴定，选取PCR呈阳性的单菌落测序。测序工作由北京六合华大基因科技股份有限公司武汉分公司完成。

1.2.3 生物信息学分析 开放阅读框的预测采用ORF Finder;数据库的检索在GenBank中进行;采用Blast程序进行相似性分析;序列的基本分析采用DNAStar 7.1程序包进行;进化树分析采用 MEGA 5.10;进化树的查看采用Treeview 32。

2 结果

2.1 Dx5 基因的克隆

图1 Dx5基因的克隆Fig.1 Cloning of Dx5 gene

PCR扩增产物经0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测后，得到一条长约2600 bp的DNA片段 (图1)，该片段长度与预期相符。回收PCR扩增产物，与pMD19-T载体连接后转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取经菌落PCR鉴定为阳性的单菌落送给华大基因公司测序。

图2 JMDx5基因序列及其编码的氨基酸序列Fig.2 The sequences and amino acid sequences of JMDx5 gene

2.2 测序结果与分析

测序结果经拼接后得到长度为2619 bp的序列。利用在线预测工具ORF Finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)进行分析发现，该序列的最大开放阅读框是+3框，长度为2520 bp(从63 bp到2582 bp)，共编码839个氨基酸残基 (图2)。Blast分析结果显示，按照+3框翻译的氨基酸序列在GenBank数据库中才能找到相似性高且完整的氨基酸序列，与Triticum aestivum x Secale cereale高分子量麦谷蛋白亚基(Sequence ID:gb|AGS18765.1|)的一致性 (Identities)达到99%(835/839)，且具有高分子量麦谷蛋白亚基结构域 (图3)，表明克隆获得的序列为Dx5基因，将其命名为JMDx5。

2.3 JMDx5的系统进化分析

利用BlastP对JMDx5序列进行蛋白质同源性搜索，去除序列的冗余，筛选JMDx5的同源蛋白质并下载，利用MEGA 5.10软件进行系统进化分析。采用Neighbor-Joining(NJ)方法构建的进化树 (图4)表明，Dx5蛋白质通过进化可能分为两大支，JMDx5在进化上具有保守性;JMDx5与斯卑尔脱小麦 (Triticum spelta)、普通小麦(Triticum aestivum)及普通小麦与黑麦的杂交后代 (Triticum aestivum x Secale cereale)的Dx5进化距离近，与长穗偃麦草 (Lophopyrum elongatum)和山羊草(Aegilops sharonensis)等的进化距离较远。

2.4 JMDx5二级结构的预测分析

登录网址 (https://www.predictprotein.org/)，将JMDx5蛋白质序列输入，对其进行二级结构预测。由图5分析可知JMDx5二级结构可能呈单一环状，没有螺旋和折叠结构，而且暴露在外和埋藏在内的氨基酸残基数目比较接近。

图3 JMDx5蛋白质保守结构域Fig.3 The conserved domains of JMDx5 protein

图4 JMDx5蛋白质系统进化树Fig.4 The phylogenetic of JMDx5 protein

图5 JMDx5蛋白质二级结构预测图Fig.5 JMDx5 protein secondary structure prediction chart

2.5 JMDx5蛋白质理化性质分析

利用在线软件 ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)对JMDx5蛋白质进行理化性质预测分析，结果显示，氨基酸分子式为C3833H5794N1190O1294S7，分子量为 8.93576 KD，等电点 pI为 6.10。稳定系数计算结果为85.02，为不稳定的蛋白质。

3 讨论

HMW-GS的组成和质量是影响小麦面粉品质的重要因子。HMW-GS中以5和10亚基对面粉的品质影响最大［6］，其中5亚基由1D染色体上 Glu-D1位点的Dx5基因所编码，其编码区无内含子，3'端有PolyA信号［13］。本研究采用蛋白质含量高的优质小麦品种济麦20，基于Blast检索和生物信息学分析，设计特异引物，直接以基因组DNA为模板，克隆获得了长度为2619 bp的序列，该序列与GenBank数据库中的Dx5蛋白质一致性达到99%，且具有HMW-GS结构域，将其命名为 JMDx5基因并提交GenBank数据，登录号为KJ144185。来源于优质小麦品种济麦20的JMDx5基因序列与已报道的Dx5基因的序列差异很小，因此，可以作为目的基因，通过转基因方法探索其在改良作物蛋白质品质的用途。

生物信息学分析表明，JMDx5基因编码含839个氨基酸残基的多肽链，分子量约为8.94 KD，等电点pI为6.10;JMDx5二级结构可能呈单一环状，没有螺旋和折叠结构，推测与其作为贮藏蛋白的功能有关;系统进化分析发现，除去小麦属植物，JMDx5与节节麦(Aegilops tauschii)的Dx5进化距离较近，这为探究济麦20品种与其它物种的进化关系提供了依据。JMDx5基因的成功克隆及生物信息学分析，为JMDx5基因表达调控机理及其与小麦蛋白质品质关系的研究打下了基础。

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