人精子顶体内透明质酸酶与男性不育关系的研究

王珂　高晓勤　邱静

【摘要】 目的：研究人精子顶体内透明酸酶（HYD）对男性生育力的影响。方法：收集不育男性精液44例，根据精液常规检查结果分为不育A、B、C、D四组；正常生育男性精液26例为正常生育组。采用改良透明质酸钠-明胶（NaHY-Gelatin）底物膜法检测精子顶体内HYD活性强度、阳性率及反应时间，研究精子形态与HYD活性强弱的关系。同时采用固定明胶底膜法检测精子顶体内蛋白酶（Acrosin），并对两种酶检测结果作直线相关分析，精液分析仪进行精液质量分析。结果：正常生育组HYD反应平均阳性率为（70.84±19.20）%，HYD活性亮区平均直径为（38.17±16.41）μm；不育组总体HYD分别为（37.01±35.13）%、（23.05±17.32）μm；不育A组分别为（60.02±29.10）%、（26.92±17.21）μm；不育B组分别为（16.11±4.64）%、（6.90±2.00）μm；不育C组分别为（29.11±11.85）%、（8.22±3.37）μm；不育D组分别为（53.04±28.60）%、（31.40±18.60）μm。正常生育组HYD反应阳性率和HYD活性强度与不育B、C组比较差异均有统计学意义（P<0.01）；与A、D组比较差异均无统计学意义（P>0.05）。Acrosin活性检测的相应数据证明人精子HYD活性与Acrosin活性呈显著正相关（r=0.810）。结论：精子内HYD活性低下是导致男性不育的重要原因之一；检测精子顶体内HYD可作为临床评价精子功能的有效指标。

【关键词】 精子； 透明质酸葡萄糖胺酶； 男性； 不育

【Abstract】 Objective： To investigate the effect of human sperm hyaluronidase on male fertile ability. Method： 44 semen samples of infertile patients were collected， and they were divided into 4 groups （A， B， C， D） according to the results of semen routine examine； 26 samples were collected from normal fertile men as control group. The improved sodium hyaluronate - gelatin substrate film technique was used to determine the acrosomal hyaluronidase active intension， positive reaction rates and the enzyme reaction time in single sperm， the relationship between sperm morphology and hyaluronidase activity were studied； at the same time， acrosin activity was determined by fixed gelatin substrate film technique， and the correlationship of the two acrosomal enzymes was analyzed. CASA was made by sperm quality analyzer . Result： In the control group， the mean positive reaction rate of the sperm hyaluronidase was （70.84±19.20）%， and the mean diameters of hyaluronidase reaction area was （38.17±16.41）?m. The infertile groups were （37.01±35.13）%， （23.05±17.32）?m . In the experimental groups A， B， C and D， the mean positive reaction of hyaluronidase were （60.02±29.10）%， （16.11±4.64）%，（29.11±11.85）% and （53.04±28.60）%； the mean diameters of hyaluronidase reaction area were （26.92±17.21）?m， （6.90±2.00）?m， （8.22±3.37）?m and （31.40±18.60）?m. There were significant statistical difference in the positive reaction rate and active intension of the hyaluronidase between the fertile group and the infertile the group B， C （P<0.01）. There were no significant statistical difference with the group A， D（P>0.05）. There were obviously statistical correlationship between hyaluronidase activity and acrosin activity （r=0.810）. Conclusion： The inactivity of sperm HYD is an important pathological reason of male infertility； detecting the activity of sperm HYD can be an clinical indicator to valuate the sperm function.endprint

【Key words】 Spermatozoa； Hyaluronoglucosaminidase； Male； Infertility

人精子顶体内透明质酸酶（HYD）为定位于顶体内膜、在酸性环境中具有HYD活性的一种糖基磷脂酰肌醇（GIP）锚着的单链膜蛋白[1]，是一种PH-20。由于环境及多重因素影响，男性不育发病率在世界上有逐年上升到趋势[2]。本研究采用一种较新的改良基质膜法及细胞孵育培养等组织学技术，通过连续观察单个精子内HYD活性反应的强弱、阳性率高低[3]，对其与精子形态学及顶体内蛋白酶之间的关系作了系统的观察、分析和对比研究。获取了关于HYD活性的若干数据，以期探明精子的形态、数量和活力与HYD活性的密切关系，以及HYD与顶体内其他酶在受精过程中相互影响情况，从理论上为男性不育症精子内HYD的研究提供基础数据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 本研究男性不育组标本均来自贵阳医学院附属医院生殖中心不育症诊察室门诊就诊者，共44例，年龄24～43岁，婚后两年以上不育。按WHO标准，根据精液质量分析仪检测及精液常规检查分析结果分为不育A、B、C、D四组。不育A组：精液常规检查无异常即不明原因婚后两年以上不生育者，共13例；不育B组：临床检测为少精或无精症患者，共12例；不育C组：临床免疫生化检查为抗精子抗体（AsAb）阳性者，共9例；不育D组：曾有泌尿生殖系统炎症或疾病史者，共10例。在检测顶体内蛋白酶（Acrosin）时将不育组仅分为两组，将精液常规检测正常的称为不育AAcrosin组，精液常规检测异常的称为不育BAcrosin组。正常生育组：有子女的健康男性提供的新鲜精液标本，常规检查各项指标均正常，共26例。

1.2 精液标本收集 禁欲1周后，于室温25～30 ℃下按摩取精液，自行液化。

1.3 仪器及设备 Anke-GL-16 G-Ⅱ高速冷冻离心机；SPX-150C型恒温恒湿箱；HHS-B型恒温水浴锅；Sartorius BS2103电子天平；伟力WLJY9000彩色精子质量检测系统；Leica DME光学显微镜，Leica DFC显微照相机及Mias摄影图像分析系统；SONY数字照片打印机。

1.4 检测方法

1.4.1 试剂及底膜制作 （1）HYD检测法：试剂包括透明质酸钠、明胶、醋酸、醋酸钠、甲苯胺兰、甲醛；双蒸水等。自制为试剂盒备用。（2）Acrosin检测法：试剂包括明胶、戊二醛、巴比妥钠醋酸缓冲液、台盼兰、pH 7.3磷酸盐缓冲液、双蒸水等，自制为试剂盒备用。

1.4.2 标本处理 采集的新鲜精液液化后，室温下以2400 r/m离心10 min，共两次，以PBS液洗两次。沉淀物悬浮于2倍以上磷酸盐缓冲液（PBS液）中，分作双份备用。

1.4.3 HYD检测法 将药盒底膜片取出放入0.2 mol/L醋酸-醋酸钠缓冲液（pH 4）20 min，以校正pH值。将上述PBS精子悬浮液1～2滴涂于药盒底膜片，置于37 ℃恒温恒湿箱孵育。3 h后取出，室温下干燥，于普通光镜下观察孵育结果。正常组取10例每例增加3张涂片分别于30 min及1、2 h后取出镜检（观察酶最早阳性反应时间）。

1.4.4 Acrosin检测法 将药盒底膜片置于巴比妥钠醋酸缓冲液缓冲10 s，取出，干燥后将精子PBS悬浮液1～2滴均匀地铺在底膜片上，置37 ℃恒湿恒温箱中孵育（其中不育组标本只有AAcrosin、BAcrosin两组）。2 h后取出，室温下干燥镜检。

1.5 分类标准及观察指标

1.5.1 标本分类 以精子质量分析仪对每份标本进行计算机辅助精液分析（CASA）并参考临床精液常规检查项目，以WHO规定标准按现有实验条件分类标本。

1.5.2 观察精子顶体HYD及Acrosin阳性率 终止孵育后，每份孵育涂片在光镜下均匀选择5～6个视野，随机观察200个精子头部，出现周围晕环者视为阳性反应。

1.5.3 酶活性强度 测微尺测量视野下每个精子头部晕环直径（即酶活性亮区）的大小，取其平均值作为判断HYD及Acrosin活性强度的指标。

1.5.4 酶反应时间 HYD孵育片于3 h后取出观察，其中10例正常生育组标本每例增加的涂片从孵育30 min后开始观察，并在设定的不同时间内计算酶的阳性反应率。由于以往研究已证明Acrosin 2 h后反应已终止，故直接于孵育2 h后取出镜检。

1.6 统计学处理 采用SPSS 15.0统计学软件对数据进行处理，计量资料以（x±s）表示，比较采用t检验，计数资料比较采用 字2检验，两种酶的相互作用采用直线相关性分析，以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组HYD的阳性率及活性强度比较

2.1.1 正常生育组 对照未加底物的正常标本孵育涂片无消化晕，不能显示HYD活性，证明该实验底膜对检测HYD的特异性。正常生育组的HYD反应平均阳性率为（70.84±19.20）%，最高阳性率可达92.45%；HYD活性亮区直径平均为（38.17±16.41）?m，最大直径可达150 ?m。

2.1.2 不育A组（不明原因不育组） HYD平均反应阳性率为（60.02±29.10）%，最高达92.86%；HYD活性亮区平均直径为（26.92±17.21）?m，最大可达96 ?m。上述两项指标与正常生育组比较差异无统计学意义（P>0.05）。

2.1.3 不育B组 HYD平均反应阳性率为（16.11±4.64）%，HYD活性亮区平均直径为（6.90±2.00）?m。该组酶活性明显较正常生育组差，差异均有统计学意义（t=10.821、4.955，P<0.01）。endprint

2.1.4 不育C组 HYD平均反应阳性率为（29.11±11.85）%，最高达78.79%；HYD活性亮区平均直径为（8.22±3.37）?m，最大直径为21 ?m。该组两项指标与正常生育组比较差异有统计学意义（t=6.842、5.559，P<0.01）。

2.1.5 不育D组 HYD反应平均阳性率为（53.04±28.60）%，最高达94.78%；HYD活性亮区平均直径为（31.40±18.60）?m，最大达90 ?m。该组两项指标与正常生育组比较差异无统计学意义（P>0.05）。

上述各组HYD的阳性率及活性亮区直径比较均见表1。

2.2 不育组总体情况与正常生育组的比较 不育组总体酶活性较正常生育组差，差异均有统计学意义（t=5.093、2.860，P<0.01），见表2。

2.3 HYD与Acrosin活性相关性分析 经直线相关分析，不育组精子顶体内HYD与Acrosin平均反应阳性率呈显著正相关性，且存在统计学意义上的正相关（r=0.810，P<0.01）。

3 讨论

研究表明，精液常规检查及精液质量分析显示为少精、精子活力差或畸形精子多的不育组，与正常生育组比较其HYD活性均明显为低。可知精子HYD的活性首先依赖于顶体的完整状态。畸形及活力差的精子其顶体也常为畸形（如顶体内外膜通透性改变、不完整或缺失），从而导致顶体反应前酶活性的散失，降低了精子穿越放射冠的能力。而对于少精症患者，其使放射冠细胞分散、放射冠移除显然极低，还常伴有精子活率低，向前运动能力差以及精子畸形率高等改变[4]。实验证明在男性不育症患者的精子中顶体HYD活性与精子浓度呈明显正相关，当精子浓度低于10×106/mL时HYD活性降到最低[5]。临床免疫生化检查为抗精子抗体（AsAb）阳性者，孵育结果提示其酶反应阳性率及酶活性强度均低于正常对照组。从免疫学观点来看，分子量超过10 KDa，表面具有一定化学结构，含苯环结构的氨基酸或自身远隔成分的自体蛋白等等，均可成为抗原[6]。人体精液内HYD即PH-20已被证明是一种远隔自体蛋白抗原。有研究发现用基因重组技术得到的重组PH-20，可完全解离围绕在鼠卵母细胞周围的放射冠细胞，而与抗PH-20抗体共育的顶体完整的精子不能穿透放射冠层到达透明带[7]。附睾功能障碍因素（如附睾炎、解脲脲原体感染）亦可引起精子顶体膜破损，使顶体内酶流失，导致部分患者不育。有研究证明，附睾功能障碍时，由附睾上皮分泌的精浆中性α-1，4G可以影响精子密度、活率、畸形精子率、HYD活性，从而影响生育[8]。

研究显示Acrosin与HYD呈显著正相关，进一步证明受精过程中顶体内多种酶系的参与和相互影响，HYD含量及活性的改变，同时会影响其他关键酶在受精过程中的作用，进而导致多因素不育[9-12]。

综上所述，尽管存在多种男性不育相关因素，精子顶体内HYD活性低下是导致男性不育的重要原因之一，检测精子顶体内HYD可作为临床评价精子功能的有效指标。在行不同类型的人工辅助生育技术（ART）、卵胞浆内单精子注射术（ICSI）时，对所采用精子的筛选亦具有重要的临床意义。

参考文献

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[2]王万荣，谭艳，谢胜.2013年欧洲泌尿科学会男性不育的遗传疾病指南介绍[J].中国医学创新，2014，11（3）：154-156.

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[10]崔应东，胡述彬.针灸治疗精索静脉曲张性不育机制的研究[J].中国医学创新，2014，11（1）：118-120.

[11]卢光琇.辅助生殖中反复植入失败的原因及对策[J].中国实用妇科与产科杂志，2010，26（10）：750-755.

[12]乜照燕，吴海峰.短时受精联合早期补救性卵胞质内单精子注射在重度畸形精子症患者中的临床应用[J].中国男科学杂志，2014，11（1）：29-33.

（收稿日期：2014-03-14） （本文编辑：蔡元元）endprint

2.1.4 不育C组 HYD平均反应阳性率为（29.11±11.85）%，最高达78.79%；HYD活性亮区平均直径为（8.22±3.37）?m，最大直径为21 ?m。该组两项指标与正常生育组比较差异有统计学意义（t=6.842、5.559，P<0.01）。

2.1.5 不育D组 HYD反应平均阳性率为（53.04±28.60）%，最高达94.78%；HYD活性亮区平均直径为（31.40±18.60）?m，最大达90 ?m。该组两项指标与正常生育组比较差异无统计学意义（P>0.05）。

上述各组HYD的阳性率及活性亮区直径比较均见表1。

2.2 不育组总体情况与正常生育组的比较 不育组总体酶活性较正常生育组差，差异均有统计学意义（t=5.093、2.860，P<0.01），见表2。

2.3 HYD与Acrosin活性相关性分析 经直线相关分析，不育组精子顶体内HYD与Acrosin平均反应阳性率呈显著正相关性，且存在统计学意义上的正相关（r=0.810，P<0.01）。

3 讨论

研究表明，精液常规检查及精液质量分析显示为少精、精子活力差或畸形精子多的不育组，与正常生育组比较其HYD活性均明显为低。可知精子HYD的活性首先依赖于顶体的完整状态。畸形及活力差的精子其顶体也常为畸形（如顶体内外膜通透性改变、不完整或缺失），从而导致顶体反应前酶活性的散失，降低了精子穿越放射冠的能力。而对于少精症患者，其使放射冠细胞分散、放射冠移除显然极低，还常伴有精子活率低，向前运动能力差以及精子畸形率高等改变[4]。实验证明在男性不育症患者的精子中顶体HYD活性与精子浓度呈明显正相关，当精子浓度低于10×106/mL时HYD活性降到最低[5]。临床免疫生化检查为抗精子抗体（AsAb）阳性者，孵育结果提示其酶反应阳性率及酶活性强度均低于正常对照组。从免疫学观点来看，分子量超过10 KDa，表面具有一定化学结构，含苯环结构的氨基酸或自身远隔成分的自体蛋白等等，均可成为抗原[6]。人体精液内HYD即PH-20已被证明是一种远隔自体蛋白抗原。有研究发现用基因重组技术得到的重组PH-20，可完全解离围绕在鼠卵母细胞周围的放射冠细胞，而与抗PH-20抗体共育的顶体完整的精子不能穿透放射冠层到达透明带[7]。附睾功能障碍因素（如附睾炎、解脲脲原体感染）亦可引起精子顶体膜破损，使顶体内酶流失，导致部分患者不育。有研究证明，附睾功能障碍时，由附睾上皮分泌的精浆中性α-1，4G可以影响精子密度、活率、畸形精子率、HYD活性，从而影响生育[8]。

研究显示Acrosin与HYD呈显著正相关，进一步证明受精过程中顶体内多种酶系的参与和相互影响，HYD含量及活性的改变，同时会影响其他关键酶在受精过程中的作用，进而导致多因素不育[9-12]。

综上所述，尽管存在多种男性不育相关因素，精子顶体内HYD活性低下是导致男性不育的重要原因之一，检测精子顶体内HYD可作为临床评价精子功能的有效指标。在行不同类型的人工辅助生育技术（ART）、卵胞浆内单精子注射术（ICSI）时，对所采用精子的筛选亦具有重要的临床意义。

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[12]乜照燕，吴海峰.短时受精联合早期补救性卵胞质内单精子注射在重度畸形精子症患者中的临床应用[J].中国男科学杂志，2014，11（1）：29-33.

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2.1.4 不育C组 HYD平均反应阳性率为（29.11±11.85）%，最高达78.79%；HYD活性亮区平均直径为（8.22±3.37）?m，最大直径为21 ?m。该组两项指标与正常生育组比较差异有统计学意义（t=6.842、5.559，P<0.01）。

2.1.5 不育D组 HYD反应平均阳性率为（53.04±28.60）%，最高达94.78%；HYD活性亮区平均直径为（31.40±18.60）?m，最大达90 ?m。该组两项指标与正常生育组比较差异无统计学意义（P>0.05）。

上述各组HYD的阳性率及活性亮区直径比较均见表1。

2.2 不育组总体情况与正常生育组的比较 不育组总体酶活性较正常生育组差，差异均有统计学意义（t=5.093、2.860，P<0.01），见表2。

2.3 HYD与Acrosin活性相关性分析 经直线相关分析，不育组精子顶体内HYD与Acrosin平均反应阳性率呈显著正相关性，且存在统计学意义上的正相关（r=0.810，P<0.01）。

3 讨论

研究表明，精液常规检查及精液质量分析显示为少精、精子活力差或畸形精子多的不育组，与正常生育组比较其HYD活性均明显为低。可知精子HYD的活性首先依赖于顶体的完整状态。畸形及活力差的精子其顶体也常为畸形（如顶体内外膜通透性改变、不完整或缺失），从而导致顶体反应前酶活性的散失，降低了精子穿越放射冠的能力。而对于少精症患者，其使放射冠细胞分散、放射冠移除显然极低，还常伴有精子活率低，向前运动能力差以及精子畸形率高等改变[4]。实验证明在男性不育症患者的精子中顶体HYD活性与精子浓度呈明显正相关，当精子浓度低于10×106/mL时HYD活性降到最低[5]。临床免疫生化检查为抗精子抗体（AsAb）阳性者，孵育结果提示其酶反应阳性率及酶活性强度均低于正常对照组。从免疫学观点来看，分子量超过10 KDa，表面具有一定化学结构，含苯环结构的氨基酸或自身远隔成分的自体蛋白等等，均可成为抗原[6]。人体精液内HYD即PH-20已被证明是一种远隔自体蛋白抗原。有研究发现用基因重组技术得到的重组PH-20，可完全解离围绕在鼠卵母细胞周围的放射冠细胞，而与抗PH-20抗体共育的顶体完整的精子不能穿透放射冠层到达透明带[7]。附睾功能障碍因素（如附睾炎、解脲脲原体感染）亦可引起精子顶体膜破损，使顶体内酶流失，导致部分患者不育。有研究证明，附睾功能障碍时，由附睾上皮分泌的精浆中性α-1，4G可以影响精子密度、活率、畸形精子率、HYD活性，从而影响生育[8]。

研究显示Acrosin与HYD呈显著正相关，进一步证明受精过程中顶体内多种酶系的参与和相互影响，HYD含量及活性的改变，同时会影响其他关键酶在受精过程中的作用，进而导致多因素不育[9-12]。

综上所述，尽管存在多种男性不育相关因素，精子顶体内HYD活性低下是导致男性不育的重要原因之一，检测精子顶体内HYD可作为临床评价精子功能的有效指标。在行不同类型的人工辅助生育技术（ART）、卵胞浆内单精子注射术（ICSI）时，对所采用精子的筛选亦具有重要的临床意义。

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[12]乜照燕，吴海峰.短时受精联合早期补救性卵胞质内单精子注射在重度畸形精子症患者中的临床应用[J].中国男科学杂志，2014，11（1）：29-33.

（收稿日期：2014-03-14） （本文编辑：蔡元元）endprint