导向激光捕获显微切割技术在贲门腺癌差异蛋白质组学的应用研究

程 妍，张 军，张 蓉，刘 冬，陈晓黎，谢丹红，龚 均

(西安交通大学医学院第二附属医院：1.消化内科；2.病理科，陕西西安 710004)

贲门腺癌是我国常见的恶性肿瘤，近年来其发病率逐年增高[1]。贲门腺癌的发病机制尚不清楚。已知贲门腺癌组织是由肿瘤实质细胞和各种间质细胞所构成的混合群体，若直接以组织块来研究肿瘤的发病机制，实验结果难免会随所研究细胞在整个组织中的含量不同而差异很大，使得研究结果的客观性和检测重复性受到了很大限制。因此，为了阐明在贲门腺癌发生和发展不同阶段特定细胞内的分子生物学改变，就需要获得单一的同类细胞群。目前组织细胞异质性已成为肿瘤疾病学研究的一大障碍[2]。

激光捕获显微切割技术(laser capture microdissection, LCM)是一项在显微镜直视下从组织切片中分离、纯化单一类型细胞群或单个细胞的技术，成功解决了细胞异质性问题，是肿瘤研究领域的一项革命性技术[3]。该技术与各种分子生物学研究方法的结合使人们对疾病演进过程分子水平的定性、定量分析更加准确易行。目前LCM多用于组织中DNA和mRNA的研究[4-5]，近年来LCM也逐渐应用于蛋白质组学研究[6-8]。但研究发现，经LCM分离获得的样本，其提取的基因和蛋白质的质量很大程度上受到了LCM过程的影响，从而限制了其在高通量研究中的应用。因此，提高LCM样本中基因和蛋白质的提取质量是目前面临的技术难题[5]。

已知LCM的样本通常要经过固定、染色、脱水、透明等一系列处理过程，固定剂和组织化学染色剂都可不同程度影响蛋白质的提取质量，从而直接影响后续的研究结果。本研究拟对LCM过程的各个环节进行优化和改进，以获得高质量的蛋白质样本并建立一套适用于贲门腺癌研究的LCM技术，为更好开展贲门腺癌蛋白质组学研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1材料手术切除的贲门腺癌及癌旁组织标本，-80 ℃保存。

1.2冰冻切片制备用恒冷切片机将冷冻的贲门腺癌及癌旁组织制备成厚度为8 μm的切片。

1.3切片处理①快速HE染色(HE染色组)：700 mL/L乙醇固定30 s；超纯水(含蛋白酶抑制剂)浸泡1 min；苏木素染色10～15 s，自来水冲洗5～10 s，然后伊红染色30 s；700 mL/L乙醇15 s，950 mL/L乙醇15 s，无水乙醇15 s×2梯度脱水，二甲苯1 min×2透明，室温完全干燥。②快速苏木素染色(苏木素染色组、LCM导向组)：除去伊红染色步骤，其余同快速HE染色。③快速阿尔新蓝[AB(pH 2.5)]染色(AB染色组、LCM导向组)：AB染液1 min，水冲；滴加100 μL核固红染液分化1 min，水冲；其余同快速HE染色。④无染色(固定剂组、NLCM组)：除去染色步骤，其余同快速HE染色。⑤无固定无染色的新鲜组织切片(对照组)。

1.4导向激光捕获显微切割采用PixCellⅡLCM系统，通过图像监视器或显微镜观察染色切片(LCM导向组)，用LCM图像分析软件(Arcturus Engineering公司)对切片上感兴趣的部位进行取图(导向图)，然后换上与染色切片相邻的无染色组织切片(NLCM组)，在导向图的指引下准确找到捕获区域，按下按钮发射低能量红外激光，细胞即黏附在转运膜上。将LCM组切割后的癌及癌旁组织切片再分别进行苏木素染色及AB染色，观察捕获结果，保证细胞捕获效率在90%以上。每个塑料帽发射激光约10 000～12 000次，捕获细胞约25 000～30 000个。每次捕获时间不超过1 h。捕获结束后，将塑料帽盖到0.5 mL离心管上，-80 ℃冻存备用。

1.5蛋白提取组织蛋白的提取: 将贲门腺癌组织切片加入等量的裂解液(7 mol/L尿素，2 mol/L硫脲，40 g/L CHAPS，40 mmol/L Tris-HCl/pH 8.8，65 mmol/L DTT，5 g/L TX-100，蛋白酶抑制剂鸡尾酒)，冰浴振荡1 h，冰浴超声数次，4 ℃，20 000 r/min离心1 h，提取上清液，Bradford法蛋白定量。

LCM细胞蛋白的提取：将1.4捕获细胞的塑料帽扣在0.5 mL的装有裂解液的离心管上，在室温下倒置约5 min，经反复振荡后，于6 000 r/min离心2 min，按同样的方法处理下一个塑料帽，直到收集到足够的细胞数，于4 ℃，20 000 r/min离心1 h，提取上清液，Bradford法蛋白定量。

1.6SDS-PAGE电泳制备120 g/L分离胶和50 g/L浓缩胶；每个样品孔内加入约20 μg样品；起始电压120 V，当溴酚蓝前沿达分离胶后，调电压至150 V，直至溴酚蓝达到胶底部；考马斯亮蓝染色2～4 h；脱色液中脱色；观察电泳结果，扫描。

1.7双向凝胶电泳选择13 cm、pH 3～10非线性IPG胶条，在蛋白质样品中加入水化液(8 mol/L尿素，20 g/L CHAPS，50 mmol/L DTT，5 g/L TX-100，50 mL/L IPG缓冲液，痕量溴酚蓝)；第一向等电聚焦电泳：20 ℃，60 μA/IPG strip，30 V 6 h、60 V 6 h、200 V 2 h、500 V 2 h、1 000 V 1 h、稳定在8 000 V，总共30 000 VhT；分别在平衡液Ⅰ(50 mmol/L Tris-HCl/pH 8.8，6 mol/L尿素，300 mL/L甘油，40 g/L SDS，0.02 g/L溴酚蓝，10 g/L DTT)和平衡液Ⅱ(50 mmol/L Tris-HCl/pH 8.8，6 mol/L尿素，300 mL/L甘油，40 g/L SDS，0.02 g/L溴酚蓝，25 g/L碘乙酰胺)中平衡15 min；第二向SDS垂直电泳：110 g/L分离胶，10 mA/gel，20 min，然后20 mA/gel至电泳结束。

银染：固定(400 mL/L乙醇，100 mL/L冰醋酸)2 h、敏化(300 mL/L乙醇，2 g/L Na2S2O3，68 g/L无水乙酸钠)30 min、Milli-Q水洗涤3次、1 g/L硝酸银染色20 min、Milli-Q水洗涤2次、显色(2.5 g/L碳酸钠/0.4 mL/L甲醛)、10 mL/L冰醋酸终止反应并保存。

1.8凝胶图像分析用光密度扫描仪采集2-DE图像，用Image Master 2D Platinum Version 5.0凝胶分析软件对图像进行分析，得到的数据列表包括蛋白质点的编号(spot)、量(volume)和面积(area)；用% volume表示每个蛋白质点的表达强度。用方差分析进行统计学分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1比较染色剂和乙醇固定剂对组织蛋白质的影响将1.3中的①～⑤种不同切片处理后的组织蛋白经SDS-PAGE电泳分离，AB染色组、HE染色组及苏木素染色组各组的蛋白质条带明显较固定剂组的模糊，固定剂组的蛋白质条带与对照组的蛋白质条带最为接近；各组蛋白质条带的强度依次是：对照组>固定剂组>苏木素染色组>AB染色组>HE染色组(图1)，说明乙醇固定剂和染色剂均对所提取的蛋白质质量有影响，且染色剂的影响大于乙醇固定剂。

图1SDS-PAGE分析染色剂和固定剂对组织蛋白质的影响

Fig.1 Effects of dyeing agents and fixing agents on tissue protein analyzed by SDS-PAGE

2.2贲门腺癌和癌旁组织的LCM切片镜下观察结果染色剂组与固定剂组(即图2的A与B、C与D)切片的镜下组织结构十分相似。固定剂组镜下组织结构较清晰，肿瘤细胞大，呈不规则腺管样结构排列，肠化生胞的胞质呈空泡状，正常柱状上皮细胞呈腺管样排列整齐。

图2贲门腺癌及癌旁组织的LCM切片镜下特点及NLCM

Fig.2 Microscopic characteristics of gastric cardia adenocarcinoma and its adjacent tissues and NLCM

A：AB染色的癌旁组织(NLCM导向图)；B：无染色的癌旁组织；C：苏木素染色的贲门腺癌组织(NLCM导向图)；D：捕获前的无染色贲门腺癌组织；E：捕获后的贲门腺癌组织；F：帽子上捕获的贲门腺癌细胞。放大倍数为A～E：×200，F：×400。

2.3NLCM的观察结果AB染色组的癌旁组织切片(图2A)及苏木素染色组的癌组织切片(图2C)分别作为LCM的导向图，固定剂组的癌旁组织切片(图2B)及癌组织切片(图2D)用于NLCM，在染色组织切片的引导下进行显微切割，贲门腺癌细胞被准确地捕获至塑料帽的表面(图2F)，切割后的地方留下空白，切片上仅残留非特异性组织(图2E)。

2.4LCM和NLCM纯化与未纯化的贲门腺癌组织的2-DE图谱比较分析为了进一步评估NLCM的方法是否可行以及探讨染色剂对蛋白质的影响，将LCM纯化的苏木素染色贲门腺癌细胞(A组)、NLCM纯化的无染色(固定剂组)贲门腺癌细胞(B组)和未显微切割的无染色无固定(对照组)的新鲜贲门腺癌组织(C组)进行双向电泳，肉眼观察发现3组的蛋白质表达图谱非常相似(图3)。经ImageMaster软件分析，A组、B组和C组分别检测到的蛋白质点数为820±25、905±74和1102±77，3组蛋白质获得的点数之间使用方差分析进行统计学检验，差异无统计学意义(P>0.05，图4)。C组的蛋白质点多于B组，两者的匹配率为78.5%。进一步分析发现，有些蛋白质点仅在C组中表达或表达明显增强，而有些蛋白质点仅在B组中表达或表达明显增强。A组的蛋白质点少于B组，两者的匹配率为83.2%。进一步分析发现，部分蛋白质点A组的表达量较B组减低或消失。另外，A组蛋白质点较B组模糊，尤以碱性端明显，说明A组蛋白的等点聚焦不好。

图3LCM和NLCM纯化与未纯化的贲门腺癌组织的2-DE图谱比较分析

Fig.3 Comparative analysis of 2-DE protein pattern of LCM and NLCM purified GCA cells and non-LCM GCA tissue

A：LCM纯化的苏木素染色的贲门腺癌细胞2-DE图谱；B：NLCM纯化的无染色贲门腺癌细胞2-DE图谱；C：未显微切割的新鲜贲门腺癌组织2-DE图谱。

图43组2-DE图谱上的蛋白质点数比较

Fig.4 Comparison of protein spot number between differentially treated groups

P>0.05。

3 讨 论

肿瘤的发生、发展是多基因调控的复杂过程。准确、深入地分析特定细胞基因结构和表达的动态变化对分子水平机制研究极为重要。如何取得纯净的目的细胞是多年来制约肿瘤研究的瓶颈。NLCM技术是在染色组织切片引导下，在相邻不染色切片上进行细胞分离，有效去除了染色剂对蛋白质的影响[9-10]。尤其是所需要研究的细胞只占样本中细胞的少数以及需研究的细胞呈散在分布时，就更需要显微切割技术获取较多且纯净的目的细胞。

贲门腺癌组织同其他肿瘤组织一样，由大量的异质性细胞构成，贲门腺癌旁的正常组织常存在贲门炎，有较多的炎性细胞，尤其是肠化生细胞常呈局灶性分布，细胞数量相对较少，如直接使用组织块进行蛋白质组表达差异研究，将无法找出真正相关细胞的表达情况，所以采用LCM分离细胞更能体现出该技术的优越性[10-11]。LIONEL等[12]已成功使用NLCM对脑组织的蛋白进行了2-DE分析，认为NLCM是一项切实可行的标本制备方法。此外，WONG等[6]用NLCM技术有效避免了免疫组织化学染色剂对mRNA降解的影响，但国内尚缺乏对NLCM技术的探讨与应用。

本实验发现贲门腺癌细胞、杯状细胞和正常柱状细胞都有其形态的特异性，即使组织切片未经染色，也可以初步凭借其细胞形态特征进行辨认，如分化好的腺癌细胞一般呈腺管状排列，肠化生细胞以杯状细胞为最突出的特点，其外观呈杯状，胞质空泡样，正常柱状上皮细胞则呈腺管样排列整齐。

LCM对于切片制备的要求非常高，通常必须经过固定、染色和脱水干燥透明。然而不同组织切片、固定液和染色液的选用对LCM技术操作以及后续的蛋白质分析的影响不容忽视。在肿瘤分子生物学研究中，尤其是高通量的表达研究，新鲜冰冻组织切片效果远优于石蜡切片。各种染色剂和固定剂均会对组织中的DNA、RNA及蛋白质产生影响，本实验结果显示700 mL/L乙醇固定剂和3种染色剂均可对蛋白质的提取量和蛋白质的表达丰度产生影响。3种染色的蛋白条带较700 mL/L乙醇固定的蛋白条带明显减少且模糊，说明LCM对蛋白质的影响主要与染色有关，这与BANKS[10]和LIONEL[11-12]等的研究结果相同。

基于以上原因，本研究借鉴了NLCM技术，在常规的LCM方法基础上做了如下改进。第一，采用苏木素和AB染色切片作为引导，在700 mL/L乙醇固定的不染色切片上进行细胞捕获，既保证了捕获的准确性，又去除了染色剂对蛋白质的影响。显微切割后，不仅可在热塑膜上观察所获细胞的形态，还可以检查被切割后的组织切片上的空白区域，故很容易进行显微切割的质量控制。第二，由于700 mL/L乙醇和900 mL/L乙醇是常用的组织固定剂，本研究改用了快速固定和脱水的方法，将700 mL/L乙醇固定时间缩短为30 s，每步梯度脱水时间缩短为15 s，尽量减少固定剂对蛋白质的影响。第三，研究发现二甲苯对蛋白质有影响，但是省略二甲苯时，组织结构就不能有效疏松，细胞不容易捕获，因为二甲苯和梯度脱水彻底与否是LCM成功的关键步骤，所以本研究将二甲苯透明时间缩短为1 min，不仅保证了清晰的形态学染色效果，同时也保证了细胞容易捕获。第四，在脱水前使用了蛋白酶抑制剂，以保持组织中蛋白质的稳定性，避免蛋白质的降解，提高了蛋白质的产量。

通过双向电泳比较LCM的苏木素染色贲门腺癌细胞与NLCM的无染色贲门腺癌细胞的蛋白表达图谱，结果发现两者的2-DE图谱非常相似，经Image Master软件检测，两者匹配率为83.2%，说明在染色的引导下，NLCM可以准确地将目的细胞分离，是一种适用于贲门腺癌研究的可靠的分离细胞技术。但LCM的苏木素染色贲门腺癌细胞蛋白图谱分辨率较低，凝胶背景颜色深，凝胶上的蛋白质点较少且较模糊，尤其是碱性端较为突出，说明苏木素染色对蛋白质提取质量影响较大，主要表现为部分蛋白质的表达丰度降低和蛋白质的等电聚焦不完全，LIONEL等[12]报道组织染色后仅有60%～80%的蛋白质复性，并且染色剂对蛋白质的等电聚焦影响明显。另外，本实验还发现在第一向等电聚焦时，LCM的苏木素染色的蛋白样品达不到8 000 V，最高电压仅为5 800 V，这可能与苏木素染色时将染色剂中的盐成分带入，增加样品中的盐离子浓度有关。因此，与LCM的苏木素染色样本相比，NLCM更适用于贲门腺癌的蛋白质组学研究。

总之，利用NLCM可以在苏木素染色切片和AB染色切片的指引下实现对贲门腺癌细胞、肠化生细胞和正常柱状上皮细胞的分离。NLCM可有效避免染色对蛋白质的影响，是一项适用于贲门腺癌蛋白质组学研究的样品制备方法。本研究建立了可靠的贲门腺癌蛋白质学研究的技术平台，为下一步开展贲门腺癌的蛋白质组学差异分析奠定了良好的基础。

参考文献：

[1] SUAREZ-QUIAN CA, GOLDSTEIN SR, POHIDA T, et al. Laser capture microdissection of single cells from complex tissues[J]. Biotechniques, 1999, 26(2):328-335.

[2] BABA N, KOBASHI H, YAMAMOTO K, et al. Gene expression profiling in biliary epithelial cells of primary biliary cirrhosis using laser capture microdissection and cDNA microarray[J]. Transl Res, 2006, 148(3):103-113.

[3] DECARLO K, EMLEY A, DADZIE OE, et al. Laser capture microdissection: methods and applications[J]. Methods Mol Biol, 2011, 755:1-15.

[4] XU BJ. Combining laser capture microdissection and proteomics: methodologies and clinical applications[J]. Proteomics Clin Appl, 2010, 4(2):116-123.

[5] RACHEL AC, NICK T, HARNDEN P, et al. Laser capture microdissection and two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis[J]. Amer J Pathol, 2002, 160(3): 815-822.

[6] WONG MH, SAAM JR, STAPPENBECK TS, et al. Genetic mosaic analysis based on Cre recombinase and navigated laser capture microdissection[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2000, 97(23):12601-12606.

[7] XU BJ, LI J, BEAUCHAMP RD, et al. Identification of early intestinal neoplasia protein biomarkers using laser capture microdissection and MALDI MS [J]. Mol Cell Proteomics, 2009, 8(5):936-945.

[8] SKVORTSOV S, SCHAFER G, STASYK T, et al. Proteomics profiling of microdissected low- and high-grade prostate tumors identifies lamin A as a discriminatory biomarker[J]. J Proteome Res, 2011, 10(1):259-268.

[9] MOULEDOUS L, HUNT S, HARCOURT R, et al. Proteomic analysis of immunostained, laser-capture microdissected brain samples[J]. Electrophoresis, 2003, 24(1-2):296-302.

[10] BANKS RE, DUNN MJ, FORBES MA, et al. The potential use of laser capture microdissection to selectively obtain distinct populations of cells for proteomic analysis—preliminary findings[J]. Electrophresis, 1999, 20(4-5):689-700.

[11] LIONEL M, SYBILLE H, REBECCA H. Navigated laser capture microdissection as an alternative to direct histological staining for proteomic analysis of brain samples[J]. Proteomics, 2003, 3(2):610-615.

[12] LIONEL M, SYBILLE H, REBECCA H, et al. Lack of compatibility of histological staining methods with proteomic analysis of laser-capture microdissected brain samples[J]. J Biomolec Tech, 2002, 13(2):258-264.