含RGD修饰的丹参酮ⅡA多级靶向纳米粒的质量评价

王炎+宋大迁+王青+范忠泽+李琦

[摘要] 目的 探讨丹参酮ⅡA多级靶向纳米粒的制备及其质量评价。 方法 采用乳化溶剂蒸发法制备丹参酮ⅡA多级纳米粒；测定丹参酮ⅡA多级靶向纳米粒的粒径分布及纳米微粒表面结构；并检测丹参酮ⅡA多级靶向纳米粒的载药量、包封率及体外药物释放规律。 结果 课题组制备的丹参酮ⅡA多级靶向纳米粒，大小均匀，载药纳米粒的平均粒径为190nm，Zeta电位为4.3mV，包封率（94.12±5.20）%，载药量（2.05±0.12）%。与游离的丹参酮ⅡA单体相比，丹参酮ⅡA多级靶向纳米粒释放速度明显减慢，在120h累积释放量为72.59%。 结论 采用乳化溶剂蒸发法成功制备了含RGD修饰的丹参酮ⅡA多级靶向纳米粒。与丹参酮ⅡA单体相比，制备成纳米制剂后，多级靶向载药纳米粒能随着时间的延长将药物逐步释放出来，具有良好的缓释特征。

[关键词] 丹参酮ⅡA；载药纳米粒；RGD；缓释；表征

[中图分类号] TQ461 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2014）05-09-03

丹参酮ⅡA（Tashinone ⅡA，TSⅡA）为传统中药丹参的有效脂溶性成分，近年来研究表明TSⅡA对肝癌、胃癌等多种消化道肿瘤具有较强的细胞毒作用[1-2]，但因丹参酮ⅡA难溶于水、体内代谢快、生物利用率低等缺点，限制其在临床上的广泛应用。课题组前期研究发现丹参酮ⅡA聚乳酸载药纳米粒（TSⅡA-PLA NPs）对肝癌有较好疗效[3-5]。本研究采用乳化溶剂蒸发法，制备含RGD修饰的丹参酮ⅡA多级靶向纳米粒（TSⅡA-mPEG-

PLGA-PLL-cRGD NPs，TNP），利用纳米技术制备的载药纳米粒可以延长药物在体内作用时间，显著提高药物的抗肿瘤作用。本实验通过对TSⅡA多级靶向纳米粒的理化性质进行评价，优选载药纳米粒的制备工艺。

1 材料与仪器

1.1 药物和试剂

丹参酮ⅡA对照品（购自中国药品生物制品检定所，纯度为99.3%）；mPEG-PLGA-PLL、mPEG-PLGA-PLL-cRGD（由上海市肿瘤研究所段友容课题组提供）；吉非罗齐（购自中国药品生物制品检定所，批号：100284-199801）；Poloxamer188（购自德国BASF公司）。

1.2 主要实验仪器

高分辨透射电镜（HIATCHIH-7000，日本日立电子公司）；激光粒度散射仪（Nicomp 380/ZLS，美国）；紫外分光光度计（德国Eppendorf公司）；微量电子分析天平（Sartotius CP225D）；低温高速离心机（Centrifuge 5804R，德国Eppendorf公司）；质谱仪（API 3000，美国ABI公司）。

2 实验方法

2.1 TNP形态及粒径分布

取实验制得的TSⅡA多级靶向纳米粒，加入纯水稀释至适宜浓度，Nicomp 380/ZLS激光粒度分析仪测定TNP的粒径。HIATCHIH-7000高分辨透射电镜考察纳米粒的形态。

2.2 测定TNP包封率及载药量

由于丹参酮为强脂溶性药物，因此未包封的药物在水溶液中大部分是以沉淀的形式存在，因此在测定包封率和载药量前，先低速离心（8000×5min）除去丹参酮沉淀。选用低温高速离心（离心条件：温度为-4℃，转速为17500×g，离心时间为30min）分离纳米粒和水溶液，取上清液测定丹参酮含量，沉淀洗涤离心两次，干燥称重得纳米粒重量。用HPLC来测定丹参酮沉淀和清液中丹参酮药物的含量。按下列公式计算包封率及载药量。

包封率=（W药-W游）/ W药×100%

载药量=（W药-W游）/ W纳米粒×100%

W药：TSⅡA总药量（mg），W游：游离TSⅡA药量（mg），W纳米粒：载药纳米粒的总重量（mg）。

2.3 TNP体外药物释放

实验采用透析法检测TNP体外药物释放率。主要步骤：精确称取TSⅡA（1mL）、TSⅡA-mPEG-PLGA-PLL（1mL）和TSⅡA-mPEG-PLGA-PLL-cRGD （1mL）各3份，之后每分分别加入PBS（2mL，pH 7.4），混匀后放入透析袋中，扎紧使其悬浮于具塞锥形瓶中，在锥形瓶中再次加入49mL 0.5% SDS生理盐水，然后将其置于恒温水浴振荡器中持续振荡（150次/min，37℃）。分别于0.5、1.5、2.5、7.5、12、18、24、48、72、96和120h取样，每次500μL，随后立即补入温度为37℃的0.5% SDS生理盐水溶液500μL。样品经HPLC测试，计算丹参酮ⅡA的浓度和累积药物释放百分比，以累积释放药物的百分率（%）对时间（hours）作图，绘制释药曲线。

3 结果

3.1 纳米粒的粒径分布及形态测试

载药纳米粒的粒径大小能够显著的影响药物在体内器官的分布。通常认为，粒径<200nm的纳米粒能够较理想的靶向于肿瘤部位。本实验制备的TSIIA多级靶向纳米粒的形态呈球型，大小均匀，外观光滑圆整，具有较好的分散性（PDI=0.240），TNP的平均粒径大小为190nm，Zeta电位为4.3mV。见图1。

3.2 纳米粒包封率和载药量的测定

结果显示，采用乳化溶剂蒸发法制备的TNP包封率为（94.12±5.20）%，载药量（2.05±0.12）%。乳化溶剂蒸发法制得的纳米粒包封率和载药量均高于溶剂-非溶剂法，并且粒径分布较好，因此选择乳化溶剂蒸发法制备纳米粒。

3.3 纳米粒体外药物释放的测定

由释放曲线可发现，游离丹参酮在12h已达到最大释放，接近100%。之后丹参酮浓度逐渐降低，原因是丹参酮在释放环境中受热分解。纳米粒表现出明显的缓释趋势：先快速释放后缓慢释放。其中mPEG-PLGA纳米粒的释放在7.5h前较快，原因可能是其载药量较大，待外层的包载的丹参酮释放完后，释放过程变得非常缓慢，TSⅡA-mPEG-PLGA-PLL和TSⅡA-mPEG-PLGA-PLL-cRGD纳米粒在120h累积释放量分别为72.26%和72.59%。endprint

4 结论

利用纳米技术制备的纳米粒子具有特定的理化性质，可作为药物载体改变药物在体内的分布特征，提高药物吸收利用度，改善药物性质和靶向性，延长药物作用时间。通过控制和修饰载药纳米粒表面性质（形状、大小、表面电荷、亲水性等）[6-8]；或者通过热敏、pH敏、磁性、超声波及电磁波响应等各种体内外刺激 [9-12]（被动靶向），以及通过连接靶向分子（如单克隆抗体、特异性的配体等），使载药纳米粒与肿瘤细胞表面能够特异性的结合[13-15]（主动靶向）；从而发挥更好的靶向作用。本课题采用乳化溶剂蒸发法成功制备了含RGD修饰的丹参酮ⅡA多级靶向纳米粒，纳米粒大小均一，光滑圆整，且分散性良好，Zeta电位为4.3mV，粒径在190nm，包封率为（94.12±5.20）%，载药量为（2.05±0.12）%。实验结果表明，制成纳米制剂后与游离的丹参酮ⅡA单体相比释放速度明显减慢，丹参酮ⅡA多级靶向纳米粒在120h累积释放量为72.59%。与丹参酮ⅡA相比，按最优处方工艺制备的丹参酮ⅡA多级靶向纳米粒具有良好的缓释特征，能够随时间的延长将药物逐步释放出来。

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[15] Díaz MR，Vivas-Mejia PE. Nanoparticles as Drug Delivery Systems in Cancer Medicine： Emphasis on RNAi-Containing Nanoliposomes[J].Pharmaceuticals （Basel），2013，6（11）：1361-1380.

（收稿日期：2013-12-11）endprint

4 结论

利用纳米技术制备的纳米粒子具有特定的理化性质，可作为药物载体改变药物在体内的分布特征，提高药物吸收利用度，改善药物性质和靶向性，延长药物作用时间。通过控制和修饰载药纳米粒表面性质（形状、大小、表面电荷、亲水性等）[6-8]；或者通过热敏、pH敏、磁性、超声波及电磁波响应等各种体内外刺激 [9-12]（被动靶向），以及通过连接靶向分子（如单克隆抗体、特异性的配体等），使载药纳米粒与肿瘤细胞表面能够特异性的结合[13-15]（主动靶向）；从而发挥更好的靶向作用。本课题采用乳化溶剂蒸发法成功制备了含RGD修饰的丹参酮ⅡA多级靶向纳米粒，纳米粒大小均一，光滑圆整，且分散性良好，Zeta电位为4.3mV，粒径在190nm，包封率为（94.12±5.20）%，载药量为（2.05±0.12）%。实验结果表明，制成纳米制剂后与游离的丹参酮ⅡA单体相比释放速度明显减慢，丹参酮ⅡA多级靶向纳米粒在120h累积释放量为72.59%。与丹参酮ⅡA相比，按最优处方工艺制备的丹参酮ⅡA多级靶向纳米粒具有良好的缓释特征，能够随时间的延长将药物逐步释放出来。

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4 结论

利用纳米技术制备的纳米粒子具有特定的理化性质，可作为药物载体改变药物在体内的分布特征，提高药物吸收利用度，改善药物性质和靶向性，延长药物作用时间。通过控制和修饰载药纳米粒表面性质（形状、大小、表面电荷、亲水性等）[6-8]；或者通过热敏、pH敏、磁性、超声波及电磁波响应等各种体内外刺激 [9-12]（被动靶向），以及通过连接靶向分子（如单克隆抗体、特异性的配体等），使载药纳米粒与肿瘤细胞表面能够特异性的结合[13-15]（主动靶向）；从而发挥更好的靶向作用。本课题采用乳化溶剂蒸发法成功制备了含RGD修饰的丹参酮ⅡA多级靶向纳米粒，纳米粒大小均一，光滑圆整，且分散性良好，Zeta电位为4.3mV，粒径在190nm，包封率为（94.12±5.20）%，载药量为（2.05±0.12）%。实验结果表明，制成纳米制剂后与游离的丹参酮ⅡA单体相比释放速度明显减慢，丹参酮ⅡA多级靶向纳米粒在120h累积释放量为72.59%。与丹参酮ⅡA相比，按最优处方工艺制备的丹参酮ⅡA多级靶向纳米粒具有良好的缓释特征，能够随时间的延长将药物逐步释放出来。

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[14] Kotagiri N，Lee JS，Kim JW.Selective pathogen targeting and macrophage evading carbon nanotubes through dextran sulfate coating and PEGylation for photothermal theranostics[J].J Biomed Nanotechnol，2013，9（6）：1008-1016.

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