全氟辛烷磺酸对雄性小鼠睾丸细胞凋亡及相关基因表达的影响

张小梅，丁 宁，刘 超，赵彩虹，裘红梅

（大连大学 医学院，辽宁 大连 116622）

全氟有机化合物，是一种持久性有机污染物，尤其是其代表性化合物全氟辛烷磺酸（PFOS）和全氟辛酸（PFOA），具有难溶性、生物蓄积性和沿食物链向高位营养级的生物体内富集的作用，已被列为持久性有机环境污染物新成员，其所造成的全球性生态系统污染已成事实。毒理学研究资料证明[1-7]，它们对实验动物及人类都造成的不只是生殖毒性，还能引起肝脏毒性、神经毒性、心血管毒性、胚胎发育与遗传毒性、致癌性、免疫毒性等。

我们实验室前期研究表明，PFOS 通过饮水染毒35 天，结果高剂量组小鼠精子活动率显著下降，5.0和10.0 mg/kg 组小鼠精子畸形率与阴性对照组比较显著增加。但对PFOS 的具体作用机制尚不清楚，本实验通过用不同浓度的PFOS 饮水染毒，观察不同染毒剂量组雄性小鼠睾丸组织细胞凋亡以及相关基因变化，来探讨全氟辛烷磺酸对雄性小鼠的生殖毒性作用的机制。

1 材料与方法

1.1 动物模型建立

健康昆明种雄性小鼠，体重18~22 g，由大连医科大学实验动物中心提供。饲养一周后，随机分为5组，每组8 只。饮水染毒，剂量分别为0 mg/kg、1.25 mg/kg、2.5 mg/kg、5.0 mg/kg、10.0 mg/kg，自由摄食，饮水。染毒35 天后摘眼球采血，颈椎脱臼处死大鼠，分离双侧睾丸、附睾等脏器，检测各指标。

1.2 流式细胞仪检测凋亡细胞

1.2.1 睾丸单细胞悬液制备

用眼科剪将睾丸组织剪成匀浆状。加入0.01 mol/L PBS 液10 mL，轻轻吹打均匀。用吸管吸取组织匀浆，用200 目筛网过滤至试管内。离心沉淀（1500 r/min，3~5 min），再用PBS 液漂洗3 次；每次漂洗后800 r/min 离心5 min，除去细胞碎片。用250 目尼龙网过滤，去除聚集的细胞团块。收集的细胞悬液做细胞计数，总量应不少于1×106个/mL。加少量PBS液用吸管反复吹打，然后用300 目尼龙网过滤，1000 r/min 离心5 min，弃去上清液，用PBS 漂洗2 次，加入冰冷的75%乙醇溶液固定（加入预冷乙醇时应不断震荡避免细胞团结成块），4℃冰箱过夜备用。

1.2.2 流式细胞仪检测

取上述固定的细胞悬液，离心弃乙醇，用PBS漂洗2 次，2000 r/min 离心5 min，收集(1~5)×105细胞。加入500 µL 的Binding Buffer 悬浮细胞。加入5 µL Annexin V-FITC 混匀后，加入5 µL Propidium Iodide 混匀，室温避光反应5~10 min。用流式细胞仪检测，激发波长为488 nm，用FACSDiva Version 6.2.1软件处理得出结果图。

1.3 RT-PCR 检测Bax 和Bcl2 基因表达

（1）睾丸组织总RNA 的提取（Trizol 法）：Trizol剂盒由大连宝生物工程有限公司提供，操作过程严格按照说明书进行。

（2）RT-PCR 反应：按照RT-PCR 试剂盒（大连宝生物工程有限公司）操作方法合成cDNA，参照文献[8]设计合成Bax，Bcl2，FAS，Fal 四对特异性引物，β-actin 作为内参，均由大连宝生物工程有限公司合成（引物信息见表1）。PCR 反应体系为20 µl，1 µL cDNA 模板，3.0 µL 10×PCR-buffer，1.0 µL 10m MdNTPs，1.0 µL 引物(50 ng/µL)，0.5 µL Ampli-Taq聚合酶，13.5 µL ddH2O。PCR 扩增条件如下：先95℃预变性2 s，然后95℃5 s、55℃（Fas 基因为60℃）15 s、72℃10 s，循环40 次，最后72℃延伸5 min。扩增后分别产生101 bp、410 bp、143 bp 、217 bp和110 bp 大小的FAS、Fal、Bax、Bcl2 和β-actin 的DNA 片段。Bax，Bcl-2，Fas，FAL 的PCR 反应结束后,取6 µL 反应液，在含0.5 µg/mL 溴化乙啶的1.5%琼脂糖凝胶中电泳，凝胶成像系统观察结果，分析目的基因扩增条带亮度，读取亮度值，为进行半定量分析，以β-actin 的亮度值作为参照，得出各个PCR 产物的相对亮度值。

表1 PCR 扩增引物序列、退火温度及长度

1.4 数据分析

2 结果

2.1 PFOS 对小鼠睾丸组织细胞凋亡的影响

细胞凋亡早期位于细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserin，PS)迁移至细胞外侧，流式细胞仪通过Annexin V-FITC 标志暴露于细胞膜上的PS 结合PI 进入损伤细胞膜标记降解DNA 分析凋亡与坏死细胞。在检测时有4 个亚群包括机械性损伤细胞(Q1：Annexin-/PI+)、凋亡晚期细胞(Q2:Annexin+/PI+)、正常细胞(Q:3：Annexin-/PI-)和凋亡早期细胞(Q4：Annexin+/PI-)被区分(如图1）。PFOS 饮水染毒，流式细胞仪检测不同染毒剂量组雄性小鼠睾丸组织细胞凋亡情况（图所1 示）。可看出，细胞凋亡率随着PFOS的浓度增加而增加，各剂量组与对照组比较均有显著性差异（p<0.05）。5.0、10.0 mg/kg PFOS 组小鼠睾丸组织细胞凋亡明显增多（p<0.01）。

图1 PFOS 对小鼠睾丸细胞凋亡的影响 （与对照组比较，*p<0.05，**p<0.01）

图2 PFOS 对小鼠睾丸组织中Bax、Bcl-2mRNA 的表达影响（与对照组比较，*p<0.05,**p<0.01）

2.2 PFOS 对小鼠睾丸细胞Bax 和Bcl-2 表达的影响

Bcl-2 家族成员Bax、Bcl-2 在线粒体损伤引起的凋亡中起重要的调节作用。采用RT-PCR 检测Bax、Bcl-2 基因mRNA 的表达量，电泳条带如图2 所示。从图2 可看出，10 mg/kg/d PFOS 实验组小鼠睾丸组织中Bax 基因表达与对照组比较显著上升（p<0.05）,其他剂量组变化与对照组比较差异无统计学意义（p>0.05）。随着染毒剂量的增加，Bcl-2 基因表达下降，5.0、10.0 mg/kg/d PFOS 实验组与对照组相比差异有统计学意义（分别为p<0.05，p<0.01）。

3 讨论

目前，人类对PFOA 和PFOS 等全氟有机化合物的环境危害、生物多样性及人体健康损害的调查研究越来越多，尤其是对哺乳动物的PFOS 毒性进行了较多的实验研究，发现PFOS 对小鼠、大鼠、家兔和猴子等动物具有一定的生殖发育毒性[4-7]。因此在现有资料的基础上，本实验用PFOS 染毒小鼠，通过观察小鼠体重、流式细胞仪检测睾丸组织细胞凋亡和RT-PCR 检测Bax、Bcl-2 基因表达变化等指标，了解PFOS 对雄性小鼠的生殖毒性作用的机制。

凋亡(apoptosis)是一种特殊的受遗传控制的细胞死亡过程,它在组织的发育和维持过程中扮演着重要角色[9]。本实验采用双染色经流式细胞仪分析后，各染毒剂量组小鼠睾丸组织细胞凋亡与对照组相比都有统计学意义（p<0.05）。在5.0、10.0 mg/kg 剂量组中，细胞凋亡总数显著增加（p<0.01）。在高剂量组中，处于凋亡早期的细胞数与对照组比较有显著性的变化（p<0.01），提示在本实验剂量水平下，PFOS 对小鼠睾丸的毒性作用较敏感。细胞凋亡是受Bcl-2 蛋白家族、调节蛋白Apaf-1(凋亡激酶激活因子1)、Caspase 蛋白家族等调控的。Bcl-2 家族包括两类成员，一类如bcl-2，bcl-xl 等是抑制凋亡发生的，另一类如bax、bak、bcl-xs、bad、bid、bik 等是促进凋亡发生的。bcl-2 位于线粒体外膜，可以与bax 结合形成bcl-2/bax 异二聚体，阻止bax 插入线粒体外膜，保护细胞免受凋亡的损害[10]。bcl-2 和bax 在组织细胞中常协同表达，bcl-2/bax 增大时促进细胞存活，反之则导致细胞死亡[11]。近年来的研究提示，Bcl-2 和Bax这两种基因均参与了睾丸细胞凋亡的过程[12]。但有报道睾丸热暴露后，Bax 从细胞质到核周重新分布进而启动凋亡，并且热暴露后6 h Bcl-2 的表达明显升高[13]。还有研究表明随着雄激素的逐渐戒断，大鼠睾丸中Bax 和Bcl-2 的表达上调[14]；体外研究还显示，Bcl-2 是凋亡的主要执行者(例如caspase-3)的底物，在凋亡过程中，caspase-3 可以剪切Bcl-2 的C2 末端，进而消除其抗凋亡活性。而且，Bcl-2 的剪切产物有与Bax 相似的前凋亡活性，通过激活下游caspases片断而触发细胞死亡[15]。这些研究显示在雄性睾丸细胞凋亡中Bcl-2 可能也具有促凋亡作用。

研究结果显示，PFOS 染毒处理的小鼠，Bax 的表达水平在最高剂量组（10.0 mg/kg）中与对照组比较有显著性增高，但其他各组与对照组的差异没有统计学意义。Bcl-2 表达水平虽然是随着染毒剂量的增加而下降，也只有在5.0、10.0 mg/kg 实验组中才表现出与对照组比较有显著性差异，较低的剂量组与对照组在统计学上无差别。说明Bax、Bcl-2 可能参与PFOS 诱导小鼠睾丸组织细胞凋亡的调控过程。

[1] Lau C, Thibodeaux JR, Hanson RG, et al. Effects of perfluo- rooctanoic acid exposure during pregnancy in the mouse [J]. Toxiool Sci, 2006, 90(2): 510-518.

[2] 羽冰, 于麒辟, 金一和, 等. 全氟辛烷磺酸对大鼠海马神经细胞内钙离子浓度的影响[J]. 毒理学杂志, 2005, 19(3): 225-226.

[3] 张璐. PFOS 对成年鹌鹑生殖系统毒性作用的实验研究[D].生态毒理学报, 2008, 13(2): 14-17.

[4] 范轶欧, 金一和, 麻懿馨, 等. 全氟辛烷磺酸对雄性大鼠生精功能的影响[J]. 卫生研究, 2005, 34(1): 37-39.

[5] 范轶欧, 金一和, 麻懿馨, 等. 全氟辛烷磺酸染毒小鼠骨髓细胞微核率和精子质量的变化[J]. 卫生毒理学杂志, 2004, 18(4): 245-247.

[6] Thibodeaux JR, Hanson RG, Rogers JM, et al. Exposure to perfluorooctane sulfonate during pregnancy in labratory rat and mouse [J]. I:Maternal and prenatal evaluations. Toxicol Sci, 2003, 74(2): 369-381.

[7] Luebker DJ, Case MT, York RG, et al. Two-generation repro- ducetion and crossfoster studies of perfluorooctanesulfonate (PFOS)in rats [J]. Toxicology, 2005, 215(1-2): 126-148．

[8] Feng Y, Shi Z, Fang X. Perfluorononanoic acid induces apoptosis involving the Fas death receptor signaling pathway in rat testis [J]. Toxicology Letters, 2009, 190(02): 102-106.

[9] Lic, Wang X, Vais H, et al. Apoptosis regulation by Bcl- x(L) modulation of mammalian inositol 1,4,5-trisphosphate recep for channel isoform gating [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2007, 104(30): 12565-12570.

[10] Shimizu S, Narita M, Tsujimoto Y. Bcl-2 family proteins regulate the release of apoptogenic cytochromec by the mitochondrial channel VDAC[J]. Nature 1999, 399: 483-487.

[11] Schabitz WR, Sommer C, Zoder W, et al. Intraveno-us brain-derived neurotrophic factor reduces infarct size and counter regulates Bax and Bcl-2 expression after temporary focal cerebral ischemia [J]. Stroke, 2000, 31(9): 2212-2127.

[12] 杨筱珍, 陈耀星, 王子旭, 等. 基因对雄性生殖细胞凋亡调控的研究进展[J]. 中国畜牧兽医, 2004, 31(1): 24-27.

[13] Yamamoto CM, Sinha H IKIM AP, Huynh PN, et al. Redistribution of Bax is an early step in an apoptotic pathway leading to germ cell death in rats, triggered bymild testicular hyperthermia [J]. Biol Reprod, 2000, 63(6): 1683-1690.

[14] WOOLVER IDGE I, DE BOER2BROUWERM, TAYLORMF, et al. Apoptosis in the rat spermatogenic epithelium following androgen withdrawal, changes in apoptosisrela- ted genes [J]. Biol Reprod, 1999, 60(2): 461-470.

[15] CHENG EHY, KIRSCH DG, CLEM RJ, et al. Conversion of Bcl-2 to a Bax-like death effector by caspases [J]. Science, 1997, 278(5345): 1966-1968.