诱导肿瘤细胞凋亡的萘酰亚胺类化合物的筛选及意义

牛 莹，刘 健，刘为国

（大连大学 医学院，辽宁 大连 116622）

细胞凋亡是人体自身耐受机制的重要步骤，诱导细胞凋亡在参与免疫应答以及免疫豁免的调控中均起重要的作用，同时与多种遗传性疾病以及肿瘤的发生具有密切联系。细胞凋亡是复杂的分子机制调控过程，可被生理或病理性因素诱发，是细胞对所处环境的某些特定信息的一种应答。诱导细胞凋亡近年成为肿瘤信号通路研究领域的重点内容，其中研究的重要贡献是设计了核酸的嵌入剂和切断剂并进行开发用于多种肿瘤的治疗，取得重要突破。目前以核酸嵌入剂为靶点的抗肿瘤药物的研发阶段成为学者的研究热点之一[1]。DNA 嵌插剂利用癌变细胞与正常细胞DNA 的差异性[2]，通过芳香环系统插入DNA 碱基对间，使DNA 构象发生变化，诱发细胞凋亡达到抗肿瘤效果。因此，DNA 嵌入剂尤其是萘酰亚胺类嵌入剂在抗肿瘤方面作用显著，将萘酰亚胺类嵌入剂作为抗肿瘤药物的靶点，活化细胞凋亡是一种理想的选择。

萘酰亚胺系列化合物通过嵌入DNA 碱基对之间，引起核酸结构发生变化诱发细胞凋亡[3]，因此如果提高它和DNA 之间的结合能力可大大增加其抗肿瘤作用,这一点对其细胞毒性至关重要；同时，侧链上的氮原子与酰亚胺环中的氮原子间隔两个碳原子时，化合物的活性最高。萘酰亚胺化合物嵌入DNA 的萘环中，如果同一取代基占据不同的位置时，活性不一样，取代基不同，药物的活性也会发生很大的变化。因此取代基特别是硝基对于萘酰亚胺的活性而言是必需基团，为了提高这类化合物对DNA 的亲和力，对母环上的取代基及母环结构进行了改造以提高化合物的水溶性和细胞毒作用[4]。

本实验设计人工合成11 种萘酰亚胺类化合物，然后用生物活性测试法（MTT）检验它们对不同实验组的肿瘤细胞的抑制作用从而进行筛选，根据实验组的不同数据结果筛选出诱导肿瘤细胞凋亡作用比较明显的萘酰亚胺类化合物C8。

1 实验试剂、仪器和细胞株

MCF-7 细胞系（人乳腺癌）、Hela 细胞系（人宫颈癌）、SMMC-7721 细胞系（人肝癌）、U-251 细胞系（人星形胶质瘤）均购自中国协和医科大学，小牛血清、RPMI1640（Hyclone，New Zealand），胰蛋白酶（北京拜尔迪生物公司）

荧光倒置显微镜（日本OLYMPUS）、冷冻离心机（Kendro）、电子天平（上海精密科学仪器厂）、酶标仪（TECAN）、灭菌锅（日本TOMY 有限公司）

2 实验方法

2.1 化合物合成及细胞培养

本实验所用化合物全部以双萘酰亚胺为母体进行合成而得到，其代码按照分子量由小到大的顺序分别为SE5、SE6、B1、B2、E1、E2、D1、C8、D2、E3、D3 共11 种化合物。取繁殖期的Hela、MCF-7、U-251 和SMMC-7721 细胞，加入细胞培养液中，于37℃ 5%CO2 环境中进行培养和细胞传代，然后用适量0.25%胰蛋白酶消化液进行消化、离心后再在培养基中继续培养达到对数生长周期。

2.2 MTT 法分析化合物对细胞的抑制活性

取对数生长周期的肿瘤细胞，Hela 细胞、MCF-7细胞、U-251 细胞和SMMC-7721 细胞，加入细胞培养液中进行消化，直至调整细胞数为5×104 个/mL。加于每板为96 孔的培养板中，然后在饱和湿度为5%CO237℃条件下培养12 h 后，在每孔加入5 g/L的MTT 10 μL，然后加入化合物培育48 h，弃MTT原液，将每孔加入10%十二烷基硫酸钠溶液100 μL静置24 h，于570 nm 测定光吸收值（参考波长为655 nm）。计算不同浓度药物的抑制率（%）并计算IC50值（半数抑制浓度）使用Bliss 法计算，然后根据IC50值确定后续实验化合物的浓度。

3 实验结果与分析

本实验通过MTT 法测试分析了目标化合物对培养的不同肿瘤细胞株(MCF-7 细胞系、Hela 细胞系、U-251 细胞系以及SMMC-7721 细胞系)的细胞毒性，结果见图1、2、3、4。可以看出，大多数化合物的体外抗肿瘤活性优于对照组，目标化合物C8 对肿瘤细胞具有比其它萘酰亚胺类化合物更强的毒性，而更低浓度的化合物C8 在作用18 h 后就显着抑制以上4种细胞的生长并随作用时间延长而增强。其中化合物SE5、SE6、B1、B2 和C8 对Hela(人宫颈癌)、MCF-7(人乳腺癌)和SMMC-7721(人肝细胞)具有良好的选择性，尤其C8 具有良好的多胺转运体识别能力及肿瘤细胞靶向性。

图1 不同浓度B1、B2、C8、D2、D3、E1、E2、E3、SE5、SE6(μm)作用12 h 对MCF-7 细胞的抑制率（%）

图2 不同浓度B1、B2、C8、D2、D3、E1、E2、E3、SE5、SE6(μm)作用12 h 对Hela 细胞的抑制率（%）

图3 不同浓度B1、B2、C8、D2、D3、E1、E2、E3、SE5、SE6(μm)作用12 h 对U-251 细胞的抑制率（%）

图4 不同浓度B1、B2、C8、D2、D3、E1、E2、E3、SE5、SE6(μm)作用12 h 对SMMC7721 细胞的抑制率（%）

化合物C8 (0～80 μM)作用12 h、18 h 和24 h 后，其半数抑制浓度值见表1。从表1 可以看出化合物C8 作用12 h、18h 以及24h 后其抑制效果随浓度不同而增强，尤其作用24h 后，IC50 值分别为18.8267、13.0274 和53.6733（µM），最低值同Hela 组相比，相差近4 倍，这表明此类化合物对肿瘤细胞具有选择性抑制作用。C8 对U-251 等三种细胞在不同时间点测得的IC50 值均不同，并随作用时间的延长，对其细胞作用的IC50 值逐渐减小（p<0.05），但对Hela细胞的抑制作用不显著（P＞0.05）。当作用时间相同，而来源不同组织的细胞，C8的IC50有显著的差异性，IC50 值由低到高的顺序为：SMMC-7721

表1 化合物C8 分别作用于肿瘤细胞株12 h、18 h 和24 h 后的IC50 浓度值

4 结论

由表1 的结果可以表明，化合物C8 对四组肿瘤细胞都具有生长抑制作用，并且随药物浓度增大和作用时间增长而增强。由图1-4 的结果分析，11 种萘酰亚胺类化合物中，化合物C8 的抑制作用最强，其抑制强度与作用时间和剂量呈正相向依赖关系。

此外，化合物C8 诱导细胞凋亡作用可能存在组织特异性，它对MCF-7、U-251 和SMMC-7721 三种细胞的生长抑制作用显著，而Hela 细胞对化合物C8的敏感性不高，提示化合物C8 抑制细胞生长作用可能具有选择性。但是，本研究并没有观察到化合物C8 抑制细胞活性作用具有明显的组织特异性。

5 讨论

萘酰亚胺化合物具有共轭平面结构[5]，能够嵌入DNA 结构从而显示较强的抗肿瘤活性，近年来受到广泛关注随着现代生物技术的发展，成为抗肿瘤药物的研究热点之一[6]。Brna 等合成的萘酞亚胺类双重嵌插剂,，芳环部分选择了氨基或硝基，它们能有效嵌入DNA 的碱基对之间[7]，在细胞体内抑制拓扑异构酶Ⅱ，从而对肿瘤细胞株的生长有明显的抑制作用[8]。 本实验通过图1-4 分析，提示化合物C8 对所有实验组均有抑制作用，但对不同组织来源细胞的抑制强度不同，对MCF-7、U-251 和SMMC-7721 肿瘤细胞生长有显著的抑制作用，相反对Hela 细胞系则不明显（P>0.5），推测化合物C8 的敏感性因组织来源不同而不同，其诱导细胞凋亡作用具有组织特异性。此实验结果与河南大学王超杰研究组合成了6 个萘酰亚胺多胺缀合物，经MTT 法对K562 白血病细胞、MB－231 人乳腺癌细胞和前列腺癌细胞进行了体外活性测试结果相符，推测其通过抑制Akt 磷酸化从而引起一系列的信号分子发生改变，如14－3－3 蛋白与Bad 解离并与Bcl-xL 结合，随后引起cytochromeC释放及caspase-9 及caspase-3 活化并最终诱导细胞凋亡；此外；还能诱导mTOR 和p70S6K 脱磷酸化，Cdk4 下调及p27kip1 上调并最终诱导细胞周期阻滞于G0/G1 期。

本实验还观察到萘酞亚胺类化合物C8 作用时间越久，这些肿瘤细胞形态学改变就越明显，如细胞出现伸展不良，胞浆内有大量颗粒状沉积物，一些细胞出现不贴壁现象，而且细胞的形态学改变随药物浓度增加更明显,提示化合物C8 可能通过线粒体等途径诱导肿瘤细胞凋亡。

总之，萘酰亚胺类化合物具有良好的抑肿瘤作用，改善其长链或短链衍生物结构是提高其抗肿瘤药物活性的重要方法。通过合成新的萘酰亚胺类化合物，使其具有更强的抗肿瘤活性，更低的毒副作用，更稳定的生物溶解性，从而为新一代抗肿瘤药物研发提供方向。

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