磷酸化mTOR及其下游分子4EBP1和S6K1在浸润性乳腺癌细胞中的定位表达研究

单美慧， 木扎帕尔·阿不都克热木， 姚雪梅， 周 梅， 孙 刚， 马斌林

(新疆医科大学1附属肿瘤医院乳腺头颈外科， 乌鲁木齐 830011； 2公共卫生学院流行病与统计学教研室, 乌鲁木齐 830011 3附属肿瘤医院病理科, 乌鲁木齐 830011)

乳腺癌是世界范围内女性发病率最高的恶性肿瘤[1]。在中国的发病率每年以3%的速度增加，已经成为中国女性最常见的恶性肿瘤[2]。mTOR(mammalian target of rapamycin雷帕霉素靶蛋白)信号通路参与调节与肿瘤密切相关的多项细胞功能如细胞增殖、细胞周期、蛋白合成、细胞迁移等，是近年来肿瘤研究的热点，4EBP1(eukaryotic translation initiation factor 4E binding protein 1真核细胞翻译起始因子4E结合蛋白1)和S6K1(Ribosomal protein S6 kinase beta-1核糖体S6蛋白激酶1)是最广泛研究的mTOR的底物。乳腺癌、前列腺癌、肺癌等许多肿瘤中都有mTOR信号通路的调节异常[3]。已经有大量研究开始关注mTOR信号通路在乳腺癌中的应用[4-7]。肿瘤细胞中的某些分子在细胞中的定位可能与肿瘤的进展和预后相关。目前对于磷酸化mTOR信号及其下游分子在浸润性乳腺癌细胞中的表达部位的研究较少，本研究对磷酸化mTOR及其下游分子p-4EBP和p-S6K1在浸润性乳腺癌细胞中的表达部位进行探讨。

1 资料与方法

1.1病例纳入和排除标准纳入标准：经手术活检证实为浸润性乳腺癌，根治性手术治疗后留有石蜡包埋的组织标本。排除标准：(1)患者术前接受过放疗、化疗或内分泌治疗。(2)肿瘤在外院已局部切除，我院无肿瘤标本。(3)男性乳腺癌和家族性乳腺癌。根据纳入和排除标准，共纳入285例乳腺癌患者。其中年龄≤45岁者157例，>45岁者128例；维吾尔族144例，汉族141例；乳腺原发肿瘤为T1者86例，T2～T4者174例；有淋巴结转移者161例，无淋巴结转移者124例，病理分期：Ⅰ期65例，Ⅱ～Ⅳ期220例；组织学分级：Ⅰ级8例，Ⅱ级205例，Ⅲ级72例。

1.2免疫组化方法

1.2.1 试剂、材料和设备 试剂:(1)一抗：p-mTOR (ser2448)购于Cell Signaling，货号为2976，抗体来源为兔，多克隆抗体，适用于人；p-S6K1(thr389)购于ABCAM，货号为ab32359，抗体来源为兔，单克隆抗体，适用于人、小鼠、大鼠；p-4EBP1(thr70)购于Millipore，货号为NRG1691074，抗体来源为兔，单克隆抗体，适用于人。 (2)二抗：HRP标记抗兔二抗购于福州迈新生物(KIT 5006)。(3) 0.01 mol/L磷酸盐缓冲液 pH7.4 。(4) 0.01 mol/L枸橼酸钠缓冲液pH6.0。 (5) DAB显色液(GK346810)购于Gene Tech。材料：人的乳腺癌组织切片。设备：电子显微镜:日本OLYMPUS CX41，朗伽(网络版)图像分析软件。

1.2.2 操作流程 (1)将石蜡切片置于烘箱中62℃烤2 h；(2)石蜡切片常规二甲苯，乙醇脱蜡至水，PBS洗5 min×3；(3)用0.01 mol/L枸橼酸钠缓冲液pH6.0煮沸热修复(95℃ 20 min),室温自然冷却, PBS洗5 min×3;(4)滴加100 μL 3%H2O2抑制内源性过氧化物酶室温孵育20 min；(5)PBS洗5 min×3；(6)10%新生胎牛血清室温孵育20 min,(7)PBS洗5 min×3；(8)一抗(p-mTOR稀释比例1∶100；S6K稀释比例1∶50；4EBP1稀释比例1∶100) 4℃ 孵育过夜，室温复温1 h；(9)PBS洗5 min×3；(10)二抗37℃孵育1 h；(11)PBS洗5 min×3；(12)DAB显色1 s～10 min，显色时间约8 s后放入ddH2O缸中终止实验；(13)苏木素复染30 s，用清水冲5 min，盐酸酒精分化1 s，再用清水冲洗5 min；(14)脱水吹干后，树脂封片； (15)镜下观察，细胞核呈紫蓝色，阳性产物呈棕黄色或黄色。

1.2.3 染色结果的判断 通过特异性抗原抗体反应，使细胞质和(或)细胞核染色，阳性染色结果呈棕黄色，染色结果由2位病理科副主任医师分别独自判读，对于不一致的判读结果经商讨后得出一致结论。

1.3统计学处理采用SPSS17.0统计学软件进行数据处理。免疫组化各指标在癌组织与癌旁组织中表达部位的对比使用配对卡方检验,检验水准α=0.05。

2 结果

p-mTOR、p-4EBP1和p-S6K1在浸润性乳腺癌及癌旁组织细胞中的染色定位结果如表1所示，在285例癌组织切片中，p-mTOR、p-4EBP1和p-S6K1的染色阳性例数分别为279例、161例和226例；在285例癌旁组织切片中，p-mTOR、p-4EBP1和p-S6K1的染色阳性例数分别为239例、81例和136例。p-mTOR 在癌组织中的表达定位在细胞核有1例，细胞浆有270例，核浆共表达有8例，在癌旁组织中的表达定位在细胞核有0例，细胞浆有234例，核浆共表达有5例，在癌组织与癌旁组织未见明显统计学差异(P=0.554)； p-4EBP1在癌组织中的表达定位在细胞核有3例，细胞浆有45例，核浆共表达有113例，在癌旁组织中的表达定位在细胞核有1例，细胞浆有6例，核浆共表达有74例，癌与癌旁组织有显著统计学差异(P=0.001)；p-S6K1在癌组织中的表达定位在细胞核有6例，细胞浆有0例，核浆共表达有130例，癌组织与癌旁组织有显著统计学差异(P=0.000)。p-mTOR的表达部位主要定位于细胞浆，在癌组织和癌旁组织表达部位没有明显差异。而p-4EBP1和p-S6K1主要共同表达于细胞核和细胞浆，与癌旁组织相比，癌组织中单独在细胞浆表达的几率明显大于癌旁组织，且差别有统计学意义(P值均<0.01)，见表1。

表1 p-mTOR、p-4EBP1 和 p-S6K1 在乳腺癌和癌旁组织中的表达部位

3 讨论

一般认为，mTOR主要存在于细胞浆或细胞膜处。很少有研究比较mTOR磷酸化后是否也是同样的情况。有研究发现，在人类恶性肿瘤细胞系的成纤维细胞以及小数成肌细胞中，mTOR主要位于细胞核；而在HEK293细胞中，mTOR却从细胞核释放出来[8]。HEK293 和 Rh30 横纹肌肉瘤混合培养体中，mTOR主要分布在细胞核，但是在细胞浆中也能被检测到。虽然mTOR蛋白可以在细胞核和细胞浆中来回穿梭[9]，本研究结果却显示，无论在乳腺癌组织还是癌旁组织，p-mTOR主要定位于细胞浆，在细胞核和细胞浆中共表达或单独表达于细胞核的情况很少。这与Penelope等[10]的报道中极为相似，认为mTOR主要定位于细胞浆或者细胞膜上，但偶尔也会在细胞核中出现。还有研究认为mTOR进入细胞核可能对激活其细胞浆信号传导有很大作用[11]。

4EBP1 和S6K1也是一种可以在细胞浆、细胞核之间穿梭的蛋白[12-13]。S6K1在细胞核中被mTOR激活，而mRNA翻译开始以后又重新分布进入细胞浆，因而许多研究报道在细胞核和细胞浆中均能检测到p-S6K1[11,14]。本研究p-4EBP1 和 p-S6K1均主要共表达于细胞核和细胞浆中。然而与癌旁组织相比有统计学差异的是，在乳腺癌组织中，两者单独在细胞浆表达的几率明显高于核-浆共表达，提示p-4EBP1和p-S6K1单独在细胞浆中的表达与乳腺细胞恶性转化有关，也可能与乳腺癌的进展和预后有关。这在最近的一些研究中可以得到证实。Elin 等[15]研究发现，p-4EBP1在细胞浆的高表达与肿瘤的高组织学级别、Her-2阳性以及肿瘤大小较大有关。p-4EBP1在细胞核中的表达与肿瘤较小、低组织学级别有关。p-4EBP1在细胞浆高表达还是一个独立预后因素，能够预测无远处复发生存率下降和乳腺癌生存率较差。p-4EBP1在细胞核中的表达与预后无关，但是细胞核高表达提示预后较好，在PR阳性亚组中更加显著。Elin等[15]还发现， S6K1在细胞核染色与ER(P=0.000 9)具有很好的相关性。S6K1在细胞浆的表达与高组织学级别和预后较差有关，尤其是在雌激素受体阳性的亚组；S6K1在细胞浆中的表达是乳腺癌的一个独立预后因素，可预测未接受系统治疗的乳腺癌患者具有复发风险增加以及较差的生存率。在ER阳性亚组中，这种预测作用更强，S6K1在细胞核中表达明显增加比在细胞浆中表达更能显示出对他莫昔芬疗效不好的关系。此外，Li等[16]对胃癌组织的研究也发现，p-S6K1在细胞核表达下调与胃癌的增殖、浸润和转移有关，还有可能被用于解释胃癌在临床病理学方面的生物学行为。

综上所述，mTOR信号通路中p-4EBP1 和 p-S6K1在浸润性乳腺癌细胞浆中表达升高与乳腺癌的发生可能相关，通过进一步研究乳腺癌组织中p-4EBP1和p-S6K1在细胞中定位表达与各临床病理学因素及患者生存指标之间的相互关系，对于临床上提示乳腺组织恶变或乳腺癌组织的恶性程度有一定的指导意义。

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