高效液相色谱仪蒸发光散射检测器校准用标准物质的选择

王婷，夏春，李丽，张强 李建兵，程莎

高效液相色谱仪蒸发光散射检测器校准用标准物质的选择

王婷，夏春，李丽，张强 李建兵，程莎

（青岛市计量测试所，山东青岛 266101） （青岛市产品质量监督检验所，山东青岛 266061）

对高效液相色谱蒸发光散射检测器（ELSD）校准用标准样品蔗糖-甲醇溶液和对乙酰氨基酚-甲醇溶液进行了研究。实验表明，用蔗糖-甲醇溶液和对乙酰氨基酚-甲醇溶液校准具有ELSD的高效液相色谱仪，其保留时间、峰面积、最低检测浓度3个参数均符合检定校准用标准物质要求。但蔗糖-甲醇溶液色谱峰的对称性差且响应值明显低于对乙酰氨基酚-甲醇溶液，因此用后者作为ELSD检校用标准物质更适合。

高效液相色谱仪；蒸发光散射检测器；蔗糖；对乙酰氨基酚

检测器作为高效液相色谱仪的一个重要组成部分，其发展在某种意义上决定着HPLC技术的进步。灵敏度高、性能稳定的通用型检测器的缺乏，在一定程度上制约了HPLC的应用［1］。液相色谱仪-蒸发光散射检测器(ESLD）是20世纪90年代开始应用的一种新型质量检测器。由于ESLD无需样品具有光吸收特性，无需带有发色团或荧光基团，对高效液相色谱仪现有的传统检测器是一个很好的补充。针对磷脂、糖类、未衍生的脂肪酸和氨基酸物质的分析和一些抗生物类的药物分离效果很好，在我国中药、食品领域有着广泛应用。

2002年实施的国家计量检定规程JJG 705-2002 《液相色谱仪》没有列入ELSD，目前对ELSD的检校还处于空白状态。2005年中国药典列出了必须使用ELSD检测的26种药品，如黄芪、银杏叶片、地肤子、知母、浙贝母、硫酸卡那霉素等［2］。随着此类检测器越来越被广泛应用，相关计量技术委员会应尽快将其列入规程规范的范围，研究补充现行液相色谱仪检定规程的ELSD的检定方法和标准物质，以实现被检仪器的有效溯源。为此笔者对ELSD检校时常用标准样品蔗糖-甲醇溶液和对乙酰氨基酚-甲醇溶液进行了研究。

1 实验部分

1．1 ELSD检测原理

ELSD检测原理是首先将柱洗脱液雾化形成气溶胶，然后在加热的漂移管中将溶剂蒸发，最后余下的不挥发性溶质颗粒在光散射检测池中得到检测。全过程主要包括流动相的雾化、流动相的蒸发、对含有待测物的剩余颗粒的光散射3个步骤。此类检测器有以下特点：信号响应与样品质量相关，可获得未知物的质量信息；多溶剂梯度可获得稳定的基线，无溶剂峰干扰，受温度影响小；分离复杂样品时，流动相中可适当添加改性剂，如乙酸铵、冰乙酸、甲酸、TFA，氨水、三乙胺等。

1．2 ELSD校准用物质的选择

根据国内外几家大型公司对ELSD的验收方法和所用校准物质的比较分析，选择蔗糖和对乙酰氨基酚进行研究。

1．3 主要仪器与试剂

高效液相色谱仪：LC-3000B型，配UM-5000型ELSD（上海通微仪器有限公司），安徽晥仪科技有限公司；

蔗糖（C12H22O11·H2O）：纯度不低于99.0%，美国Sigma公司；

对乙酰氨基酚（C8H9NO2）：纯度不低于99.0%，美国Sigma公司；

甲醇：色谱纯，美国Sigma公司。

1．4 色谱条件

色谱柱：ENDURO C18(250 mm×4.6 mm ，5μm)；流动相：甲醇，流速为1.0 mL／min；漂移管温度：30℃；氮气压力：3.0×105Pa；进样体积：20 μL。

1．5 标准溶液配制

分别精确称取25 mg蔗糖和对乙酰氨基酚于250 mL容量瓶中，加入甲醇溶解并定容至刻度，混匀，即得质量浓度为1.0×10-4g／mL的标准溶液。分别精确称取50 μg蔗糖和对乙酰氨基酚于500 mL容量瓶中，加入甲醇溶解并定容至刻度，混匀，即得质量浓度为1.0×10-7g／mL的标准溶液。

2 结果与讨论

2．1 保留时间和峰面积测定

在1.4色谱条件下，分别对1.0×10-4g／mL的蔗糖-甲醇溶液和对乙酰氨基酚-甲醇溶液进行分析，色谱谱图见图1、图2，保留时间、峰面积及相对标准偏差见表1。JJG 705-2002［3］中3.4 节整机性能要求定性测量重复性（6次测量结果的相对标准偏差）不超过1.5%；定量测量重复性（6次测量结果的相对标准偏差）不超过3.0%。由表1可知，保留时间、峰面积两个参数均符合检定校准用标准物质的要求。

从图1、图2可以看出，蔗糖-甲醇溶液色谱峰的对称性不如对乙酰氨基酚-甲醇溶液色谱的对称性好。由表1可知，蔗糖-甲醇溶液和对乙酰氨基酚-甲醇溶液的出峰时间接近，而蔗糖-甲醇溶液稍早些，蔗糖-甲醇溶液的保留时间重复性优于对乙酰氨基酚-甲醇溶液。若参照现行JJG 705-2002《液相色谱仪检定规程》，两者均符合要求，两种溶液的色谱峰面积重复性接近，但对乙酰氨基酚-甲醇溶液的响应值比蔗糖-甲醇溶液要高。

图1 蔗糖-甲醇溶液色谱图

图2 对乙酰氨基酚-甲醇溶液色谱图

2．2 最低检测浓度的测定

在1.4色谱条件下，对1.0×10-7g／mL的蔗糖-甲醇溶液和对乙酰氨基酚-甲醇溶液进行分析，最小检测浓度按下式计算：

式中：cL——最低检测浓度，g／mL；

Nd——基线噪声的峰高，mV；

c——标准溶液质量浓度，g／mL；

H——标准溶液色谱峰高，mV；

V——进样体积，μL。

标准溶液色谱测定数据见表2。根据表2数据计算得蔗糖-甲醇溶液最低检测浓度为3.9×10-10g／mL，对乙酰氨基酚-甲醇溶液的最低检测浓度为7.5×10-10g／mL，符合JJG 705-2002规定的各检测器检测浓度不超过1.0×10-9～1.0×10-6g／mL的要求，与目前大多数ELSD的检测限指标处在1.0×10-10～1.0×10-7g／mL范围内［4］相一致。

表2 两种标准溶液的最低检测浓度测定结果

3 结论

ELSD检测器是一种通用型检测器，检测器信号响应与样品质量相关，可获得未知物的质量信息，是一种质量型检测器，它消除了高效液相色谱仪其它常见检测器的问题。示差检测器受溶剂前沿峰的干扰使得分析复杂化，并且由于对温度极其敏感使基线不稳定，与梯度洗脱不相容。另外示差检测器的响应不如ELSD灵敏。低波长紫外检测器在急变梯度条件下受基线漂移的困扰，并要求被分析化合物带有发色团，而ELSD则不受这些限制，未来在食品、药品领域的应用会越来越广泛。

经研究可知，蔗糖-甲醇溶液和对乙酰氨基酚-甲醇溶液用于标准物质进行计量检定，其保留时间、峰面积、最低检测浓度这3个参数均符合检定校准用标准物质要求。但蔗糖-甲醇溶液色谱峰的对称性差且响应值低于对乙酰氨基酚-甲醇溶液，所以后者作为检校用标准物质更适合。由于不同厂家仪器的设计理念相差很大［5］，对于所有厂家不同型号的检测器是否适用还需要做大量实验进行验证。

［1］ Brown P R. High-performance liquid chromatography past developments, present status, and future trends［J］.Anal Chem，1990，62(19):995-1 008.

［2］ 国家药典委员会.中华人民共和国药典（2005）[M].北京：化学工业出版社，2005.

［3］ JJG 705-2002 液相色谱仪检定规程［S］.

［4］ 阳金勇.液相色谱用ELSD蒸发光散射检测器简介与校准方法研究［J］.科教视野，2007，25: 324-325.

［5］ 何海红.高效液相色谱用蒸发光散射检测器检定方法研究［J］.化学分析计量，2010，19(2): 78-80.

Selection of Reference Material in Calibrating Evaporative Light Scattering Detector for High Performance Liquid Chromatography

Wang Ting， Xia Chun， Li Li， Zhang Qiang
(Qingdao Institute of Measurement and Testing， Qingdao 266101， China)
Li Jianbing， Chengsha
(Qingdao Supervision and Testing Center of Product Quality， Qingdao 266061， China)

Saccharose methanol solution and acetaminophen methanol solution were studied for verification and calibration of the evaporative light scattering detector (ELSD)used in high performance liquid chromatography. The results showed that both saccharose methanol solution and acetaminophen methanol solution could meet the requirement of verification and calibration on retention time，peak area and the minimum detectable concentration. The peak of acetaminophen methanol solution was better than saccharose methanol solution on symmetry and response.Acetaminophen methanol solution is more suitable to be the reference material for veri fi cation and calibration of ELSD.

high performance liquid chromatography; evaporative light scattering detector; saccharose; acetaminophen

O657.7

A

1008-6145(2014)01-0001-03

联系人：王婷；E-mail：249295196@qq.com

2013-10-29

10.3969／j.issn.1008-6145.2014.01.001