保加利亚乳杆菌微囊化活菌制剂的研究

关海滨，董至恒，包小妹，石瑞文，乔俊缠

（内蒙古医科大学药学院，内蒙古呼和浩特010110）

保加利亚乳杆菌微囊化活菌制剂的研究

关海滨，董至恒，包小妹，石瑞文，乔俊缠*

（内蒙古医科大学药学院，内蒙古呼和浩特010110）

制备保加利亚乳杆菌的微囊化制剂。液体发酵法制备保加利亚乳杆菌，以海藻酸钠为囊材制备保加利亚乳杆菌微囊。微囊化保加利亚乳杆菌的冻干存活率为45.07%，与传统方法（冻干存活率为44.35%）相比，差异无统计学意义。人体胃液和肠液耐受性试验结果显示，在人体胃液中微囊化的菌体3 h后菌体存活率达到71.16%，而对照的存活率仅为16.47%；在人体肠液中微囊化的菌体6h后菌体存活率达到71.67%，而对照的存活率仅为30.46%。微囊起到了保护保加利亚乳杆菌免受人体胃液和肠液破坏的作用。

保加利亚乳杆菌；微囊；海藻酸钠；存活率

微生态制剂因其具有“患病治病，未病防病，无病保健”的效果。已经广泛应用于保健食品和药品中[1]。微生态制剂，是通过加入对人体有益的微生物，从而调整胃肠道微生态的平衡，控制菌群失调、促进内环境的稳定、提高人体的健康水平[2]。保加利亚乳杆菌（Lactobacillusdelbrueckiisubsp.bulgaricus）对人体的健康起到非常重要的作用，保加利亚乳杆菌属于德氏乳杆菌属，保加利亚亚种，保加利亚乳杆菌繁衍至今已经遍布全世界[3]。由于保加利亚乳杆菌具有促进胃肠道消化吸收、增加免疫、抗癌等重要的生理功能，因此被规定为可用于保健食品和药品的益生菌菌种之一，在医药、乳品、饲料添加剂、保健品等领域广泛应用[4-6]。目前一些大品牌的酸奶、奶油、干酪以及临床上应用的微生态制剂培菲康、金双歧都含有保加利亚乳杆菌，随着生物技术的进一步发展，保加利亚乳杆菌的性能将会被进一步开发[7-8]。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌源

保加利亚乳杆菌（Lactobacillusdelbrueckiisubsp. bulgaricus）：中国工业微生物菌种保藏管理中心。

1.1.2 试剂和仪器

MRS液体培养基：葡萄糖1.0%、蛋白胨1.0%、酵母膏1.0%、牛肉粉0.5%、乙酸钠0.5%、柠檬酸三铵0.5%、吐温-80 0.1%、MgCl20.05%、MnCl20.02%、K2HPO40.05%，用5.0%的NaOH调节pH为7.0~7.2。MRS固体培养基：MRS液体培养基加入1.5%的琼脂，121℃灭菌30min，至4℃冰箱保存。冻干保护剂：乳糖50%、脱脂奶粉25%，115℃灭菌20min，至4℃冰箱保存。模拟人体胃液：NaCl0.3%、KCl0.2%、胃蛋白酶0.5%，用HCl调节pH为2.0，0.22μm微孔滤膜过滤灭菌。模拟人体肠液：KH2PO40.5%、胰蛋白酶0.3%，用NaOH调节pH为8.0，0.22μm微孔滤膜过滤灭菌。Thermo Scientific 1029厌氧培养箱：美国Thermo公司；CX21-BIM显微镜：日本OLYMPUS公司；FD-2.5E冻干机：美国SIM公司。

1.2 方法

1.2.1 保加利亚乳杆菌的培养及发酵液活菌数的测定

菌种的扩大培养采取三级发酵培养，具体操作过程为：将一支冻干菌种接入装量为60mLMRS液体培养基的100mL三角瓶中，37℃厌氧培养12 h后取出，作为一级种子；一级种子按5%的接种量接入装量为150mLMRS液体培养基的250mL三角瓶中，37℃厌氧培养12 h后取出，作为二级种子；二级种子按5%的接种量分别接入6个装量为400mLMRS液体培养基的500mL三角瓶中，37℃厌氧培养12 h后取出，得到三级发酵液，平板计数法检测发酵液活菌数，方法参照GB/T4789.2-2003《食品卫生微生物学检验菌落总数测定》。

1.2.2 微囊的制备及冻干微囊与冻干菌粉存活率的比较

取1 L发酵液8 000 r/min离心30min，弃去上清液，将离心得到的菌泥与30mL冻干保护剂混合，加入到60 mL海藻酸钠（3.0%）溶液中，混匀，滴入若干1.1%的CaCl2，固化30min，过滤收集微囊，冷冻干燥，得到保加利亚乳杆菌微囊27.4 g。称取冻干微囊1.0 g，加入到10mL 0.12mol/LNa2HPO4和0.04mol/L柠檬酸的缓冲液（pH 7.2）中，剧烈震荡15min使微囊充分溶解，梯度稀释，平板计数法检测活菌数。保加利亚乳杆菌的冻干微囊存活率等于冻干微囊的总活菌数比发酵液总活菌数。

取1 L发酵液8 000 r/min离心30min，弃去上清液，将离心得到的菌泥与30mL冻干保护剂混合，冷冻干燥，得到保加利亚乳杆菌乳杆菌菌粉21.8 g。称取冻干菌粉1.0 g，加入到10mL 0.12mol/LNa2HPO4和0.04mol/L柠檬酸的缓冲液（pH 7.2）中，剧烈震荡15min使菌粉充分溶解，梯度稀释，平板计数法检测活菌数。保加利亚乳杆菌的冻干菌粉存活率等于冻干菌粉的总活菌数比发酵液总活菌数。

1.2.3 保加利亚乳杆菌微囊在模拟人体胃液中的存活试验

取5 g保加利亚乳杆菌微囊加入到50mL模拟人体胃液中，37℃水浴，分别在0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5和3.0 h取样。以相同活菌总数的保加利亚乳杆菌冻干菌粉4.04 g为对照，平板计数法检测人体胃液中活菌数的变化。

1.2.4 保加利亚乳杆菌微囊在模拟人体肠液中的存活试验

取5 g保加利亚乳杆菌微囊加入到50mL模拟人体肠液中，37℃水浴，分别在0、1、2、3、4、5、6h取样。以相同活菌总数的保加利亚乳杆菌冻干菌粉4.04 g为对照，平板计数法检测人体肠液中活菌数的变化。

2 结果

2.1 保加利亚乳杆菌发酵液活菌数的测定

经测定，保加利亚乳杆菌发酵液活菌数为（15.73± 0.91）×108CFU/mL（n=4）。

2.2 冻干微囊与冻干菌粉存活率的比较

经测定，保加利亚乳杆菌冻干微囊活菌数为（258.75±7.93）×108CFU/g（n=4）。冻干微囊存活率=（258.75×108CFU/g×27.4 g）/（15.73×108CFU/mL× 1 000mL）=45.07%。经测定，保加利亚乳杆菌冻干菌粉活菌数为（320.00±8.29）×108CFU/g（n=4）。冻干菌粉存活率=（320.00×108CFU/g×21.8 g）/（15.73× 108CFU/mL×1 000mL）=44.35%。

保加利亚乳杆菌冻干微囊的存活率为45.07%，使用传统方法制备的保加利亚乳杆菌冻干菌粉的存活率为44.35%，两者比较并未有明显差别，可见，微囊对冻干存活率的影响较小。

2.3 保加利亚乳杆菌微囊在模拟人体胃液中存活试验

由表1、2可知，在模拟人体胃液中，微囊化的保加利亚乳杆菌活菌数缓慢下降，3 h后活菌数由（254.00±5.60）×108CFU/g（n=4）降低至（180.75±3.59）× 108CFU/g（n=4），存活率达到71.16%。而直接加入保加利亚乳杆菌菌粉，其活菌数快速下降，3 h后活菌数由（258.00±7.39）×107CFU/g（n=4）降低至（42.50±4.80）× 107CFU/g（n=4），存活率为16.47%。

2.4 保加利亚乳杆菌微囊在模拟人体肠液中存活试验

由表3、4可知，在模拟人体肠液中，微囊化的保加利亚乳杆菌活菌数缓慢下降，6 h后活菌数由（255.00± 7.07）×107CFU/g（n=4）降低至（182.75±4.34）×107CFU/g（n=4），存活率达到71.67%。而直接加入保加利亚乳杆菌菌粉，其活菌数快速下降，6 h后活菌数由（255.25±9.54）×107CFU/g（n=4）降低至（77.75±8.62）×107CFU/g（n=4），存活率为30.46%。

表1 保加利亚乳杆菌微囊对模拟人体胃液的耐受性Table1 Toleranceof Lactobacillusbulgaricus m icrocapsule to artificialgastric juice

表2 保加利亚乳杆菌菌粉对模拟人体胃液的耐受性Table2 Toleranceof Lactobacillusbulgaricus powder to artificialgastric juice

表3 保加利亚乳杆菌微囊对模拟人体肠液的耐受性Table3 Toleranceof Lactobacillusbu lgaricus m icrocapsule to artificial intestinal juice

表4 保加利亚乳杆菌菌粉对模拟人体肠液的耐受性Table4 Toleranceof Lactobacillusbulgaricus powder to artificial intestinal juice

3 讨论

微囊是利用天然或合成的高分子材料作为囊壳，将固态或液态药物包裹成为微型胶囊，微囊可以掩盖食品、药物的不良气味，还能提高其稳定性，减少食品、药物对胃肠的刺激[9，11]。本实验使用海藻酸钠作为囊壳材料，将保加利亚乳杆菌包裹在微囊内。通过冷冻干燥得到保加利亚乳杆菌微囊，微囊的冻干存活率达到45.07%，而使用传统方法制得的保加利亚乳杆菌菌粉冻干存活率为44.35%，两者的冻干存活率没有明显差别，可见微囊化对保加利亚乳杆菌的冻干存活率没有影响。

含益生菌类的食品、药品的活性关键在于菌体是否存活，在人体内，结肠的环境适合细菌生存，是肠道细菌的主要栖息地，但口服含益生菌类的食品、药品必须经过胃和小肠，胃液的强酸性和所含的胃蛋白酶能杀死大多数细菌，肠当中的胰蛋白酶也会杀死大量细菌[12-14]。本实验中，以微囊包裹保加利亚乳杆菌，通过模拟人体胃液和肠液实验，保加利亚乳杆菌微囊可以很好的抵御酸、碱环境以及胃蛋白酶和胰蛋白酶。在模拟人体胃液中，大多数益生菌难以耐受pH 2.0的酸性环境和胃蛋白酶的作用，在作用3 h后保加利亚乳杆菌微囊存活率为71.16%，对照保加利亚乳杆菌菌粉的存活率为16.47%，微囊使保加利亚乳杆菌在胃液中的存活率明显提高。在模拟人体肠液中，pH 8.0的碱性环境和胰蛋白酶的作用也会造成菌体的大量死亡，在作用6 h后保加利亚乳杆菌微囊存活率为71.67%，对照保加利亚乳杆菌菌粉的存活率为30.46%，微囊使保加利亚乳杆菌在肠液中的存活率明显提高。

市售含益生菌类的食品、药品大多是片剂、胶囊和散剂，菌体经过胃肠时很难受到保护，能存活下来的菌体很少，而微囊能提高菌体的存活率。因此，益生菌微囊的开发和利用对食品、药品、饲料添加剂和保健品新产品的研发有广阔的前景。

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Research on the M icroencapsulation of Lactobacillus bulgaricus

GUANHai-bin，DONGZhi-heng，BAOXiao-mei，SHIRui-wen，QIAO Jun-chan*

（Pharmacy College，Inner Mongolia Medical University，Hohhot010110，Inner Mongolia，China）

To preparemicroencapsulation of Lactobacillusbulgaricus.Liquid fermentation technologywasused to prepare Lactobacillus bulgaricus，sodium alginate asmicro-capsule material.Freeze dry survival rate of microencapsulation Lactobacillus bulgaricus was 45.07%，no significant difference was found compare to traditionalmethod（survival rate44.35%）.Mimichuman gastric juiceand intestinal juice tolerance testshowed that，microcapsules survival in human gastric juice 3 hours，cell survival ratewas 71.16%，while the control survival ratewas16.47%.In the human intestinal juice，after 6 hoursmicroencapsulated cell survival ratewas 71.67%，while the control survival rate was 30.46%.Microcapsule plays a protective role for Lactobacillus bulgaricus from humangastricand intestinal juiceeffect.

Lactobacillusbulgaricus；microcapsules；alginate；survival rate

2014-05-27

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.23.017

内蒙古自治区高等学校科学研究项目（NJZY14139）；内蒙古自治区自然科学基金项目（2011MS1211）

关海滨（1982—），男（满），讲师，硕士研究生，从事微生物药物、食品及制剂方面的研究。

*通信作者：乔俊缠，男（汉），教授，本科，从事微生物药物、生态学方面的研究。