AB-8和D-101大孔吸附树脂分离纯化玉竹多糖

杨波，韩凤波，杨波

（1.吉林农业科技学院，吉林吉林132101；2.吉林省农业科学院洮南综合试验站，吉林洮南137100）

AB-8和D-101大孔吸附树脂分离纯化玉竹多糖

杨波1，韩凤波1，杨波2

（1.吉林农业科技学院，吉林吉林132101；2.吉林省农业科学院洮南综合试验站，吉林洮南137100）

以葡萄糖为标准品，利用大孔吸附树脂分离纯化玉竹多糖，结果表明AB-8大孔吸附树脂分离纯化玉竹多糖的最佳上样浓度为1.0mg/mL，最佳洗脱浓度为75%乙醇，最佳流速为1.0mL/min，洗脱液体积为上样的10BV，玉竹粗多糖的纯度从65.23%提高到78.64%；D-101大孔吸附树脂分离纯化玉竹多糖的最佳上样浓度为0.6mg/mL，最佳洗脱浓度为50%乙醇，最佳流速为1.0mL/min，洗脱液体积为上样的10.5BV，玉竹粗多糖的纯度从65.23%提高到73.79%。AB-8大孔吸附树脂对玉竹多糖的分离纯化效果优于D-101大孔吸附树脂。

玉竹多糖；分离纯化；AB-8大孔吸附树脂；D-101大孔吸附树脂

玉竹（Polygonatum odoratum（Mill）Druce）为百合科多年生草本植物，主要分布于我国的东北、华北、内蒙、西北等地，干燥根茎入药[1]。最早以萎蕤之名载于《神农本草经》，列为上品，是我国常用中药材。性平，味甘，具有养阴润燥、生津止渴的功能。用于热病口燥咽干、干咳少痰、心烦心悸、糖尿病等。研究表明，玉竹的醇提物能增强免疫力，煎剂有扩张冠脉、抗急性心肌缺血、降压、抗衰老、抗菌作用，注射液有降血脂、抗动脉粥样硬化、抗肿瘤作用[2]。除作药用外，在沿海一带和东南亚国家还作为食品、饮料、保健品、化妆品与美容[3]。目前从玉竹中已经分离鉴定了甾体皂苷、黄酮、生物碱、多糖、甾醇、鞣质、黏液质和强心苷等多类成分[4]。

玉竹多糖是玉竹中主要有效成分之一，现代药理实验研究表明其具有明显的生理活性，具有抗肿瘤[5]、降血糖[6]、抗氧化[7]等作用，因此开发玉竹多糖具有重要意义。玉竹多糖的提取工艺已经有很多文献报道，但是对玉竹多糖的分离纯化研究尚未见报道。常用的分离纯化方法有Tca法、Sevag法[8]、酶法、Sevag法和酶法并用[9]；但是效果一般，而且无法广泛推广，不适于工业生产。

大孔树脂法作为一种常用的分离纯化方法，因其具有吸附容量大、吸附速度快、选择性好、再生简便等优点，因而被广泛用于天然产物的分离纯化[10-17]。本文通过D101和AB-8两种大孔树脂从玉竹中分离纯化了玉竹多糖，对其吸附性能进行比较，选用不同浓度的多糖溶液考察静态吸附率，解吸率，选择最佳洗脱浓度和洗脱流速，选择最佳纯化工艺，为工业化生产和进一步开发利用提供理论参考，具有现实意义。

1 材料

玉竹采自吉林农业科技学院药植园；AB-8型、D-101型大孔吸附树脂：西安蓝晓科技新材料股份有限公司生产。

2 方法

2.1 粗多糖的提取

将玉竹粉碎称取450 g加2 700mL水，80℃恒温提取1 h，浸提3次合并提取液，浓缩至300mL，用无水乙醇2 700mL沉淀12 h，过滤，沉淀烘干至恒重，得到粗多糖干粉。

2.2 标准曲线的制备

葡萄糖对照品溶液的制备：精密称取105℃干燥至恒重的无水葡萄糖6.0mg，加蒸馏水定容至100mL容量瓶中，摇匀，即得0.06mg/mL的葡萄糖标准溶液。

精密量取葡萄糖标准溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL于小试管中，分别加蒸馏水补足至2.0mL，再分别加入苯酚溶液1.0mL，快速滴加浓硫酸溶液7mL，充分摇匀，放置使其充分反应，另以蒸馏水2.0mL加入苯酚试液和浓硫酸同上操作作为空白，40℃水浴30min，再冰浴5min。紫外可见分光光度计，在490 nm处测定其吸光度，绘制标准曲线。

2.3 粗多糖纯度的测定

取0.183 2 g粗多糖置于500mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，取2mL多糖溶液按照2.2的方法测定吸光度，计算纯度。

2.4 大孔吸附树脂的预处理

称取AB-8和D-101大孔吸附树脂各200 g，用蒸馏水充分淋洗，除去表面杂质，再用无水乙醇浸泡24 h，充分溶胀。弃去无水乙醇，用蒸馏水冲洗至无醇味，然后用4%HCl溶液浸泡3 h，蒸馏水洗至中性，再用4%NaOH溶液浸泡3 h，蒸馏水洗至中性，备用。

2.5 AB-8大孔吸附树脂工艺条件考察

2.5.1 AB-8大孔吸附树脂静态饱和吸附率考察

2.5.1.1 样品液制备

称取7.692 3 g粗多糖置于500mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度（15.836mg/mL），按需要稀释成不同浓度，备用。

2.5.1.2 静态吸附考察

称取10mL的AB-8大孔吸附树脂置于50mL的锥形瓶中，充分摇匀，分别用10、5、2.5、1.5、1.0、0.6、0.5mg/mL的多糖溶液10mL进行静态吸附，滤出上清液，以molish反应检测，观察上清液中是否有糖的存在，重复3次，确定上样浓度。

2.5.2 AB-8大孔吸附树脂的动态吸附

用2.5.1实验得到的最佳上样浓度10mL上柱，以不同浓度的乙醇洗脱液50mL进行洗脱，流速控制在1.0mL/min，收集洗脱液，重复3次，测吸光度，考察动态吸附率。

2.5.3 AB-8大孔吸附树脂最佳流速的选择

用2.5.1实验得到的最佳上样浓度10mL上柱，以75%乙醇50mL，流速分别以0.5、1.0、2.0、3.0mL/min进行洗脱，重复3次，测吸光度，确定最佳流速。

2.5.4 AB-8大孔树脂洗脱液体积的选择

用2.5.1实验得到的最佳上样浓度上样5mL，用

2.5.2 得出最佳洗脱浓度、2.5.3得到最佳洗脱流速进行洗脱，至洗脱液中molish反应阴性为止，重复3次，确定洗脱液体积。

2.6 D-101大孔吸附树脂工艺条件考察

2.6.1 D-101大孔吸附树脂静态吸附考察

称取10mL的D-101大孔吸附树脂置于50mL的锥形瓶中，充分摇匀，分别用10、5、2.5、1.5、1、0.6、0.5mg/mL的多糖溶液8mL进行静态吸附，滤出上清液，进行molish反应，观察上清液中是否有糖的存在，重复3次，确定上样浓度。

2.6.2 D-101大孔吸附树脂的动态吸附

用2.6.1实验得到的最佳上样浓度10mL进行上柱，后用不同浓度的乙醇洗脱液100mL进行洗脱，流速控制在1.0mL/min，收集洗脱液，重复3次，测吸光度，考察动态吸附率。

2.6.3 D-101大孔吸附树脂最佳流速的选择

用2.6.1实验得到的最佳上样浓度10mL进行上柱，后用50%乙醇100mL进行洗脱，流速分别控制在0.5、1.0、2.0、3.0mL/min，重复3次，测吸光度，确定最佳流速。

2.6.4 D-101大孔吸附树脂洗脱液体积的选择

用最佳上样浓度上样5mL，用最佳洗脱浓度，最佳洗脱流速进行洗脱，直至洗脱液中不发生molish反应为止，重复3次，记下洗脱液体积。

2.7 验证试验

量取AB-8大孔树脂和D-101大孔树脂各50mL装柱，按照试验确定的最佳工艺上样洗脱，测量吸光度，烘干洗脱液得到烘干物的质量，按照2.3法测定含量，重复3次，考察工艺稳定性。

3 结果与分析

3.1 多糖的提取量

通过2.1的提取方法进行提取、沉淀、烘干、精密称定，40.905 4 g，提取率为6.84%。

3.2 标准曲线的制备

由2.2的实验方法绘制标准曲线见图1。

图1 葡萄糖标准曲线Fig.1 G lucose standard curve

由图1可以看出：浓度在0.0194mg/mL~0.097mg/mL范围内，浓度与吸光度线性关系良好。

3.3 粗多糖干粉的纯度

按照2.3的多糖测定方法测定其吸光度为0.606、0.605、0.607，计算粗多糖的纯度为65.229%。

3.4 确定最佳上样浓度

通过2.5.1和2.6.1的实验方法得到以下结果，显示洗脱液中是否有多糖。由表1选择出AB-8大孔吸附树脂的最佳上样浓度为1.0mg/mL，D-101大孔吸附树脂的最佳上样浓度为0.6mg/mL。

表1 静态吸附Table1 Static adsorption

3.5 洗脱液最佳浓度确定

按照不同浓度洗脱树脂，结果见图2。

图2 不同浓度洗脱液的吸光度Fig.2 Eluentabsorbanceat different concentrations

由图2可知AB-8大孔吸附树脂洗脱液的吸光度随着乙醇的浓度的增加而增加，但是增加不大，为考虑节省实验材料所以选择75%的乙醇为最佳洗脱浓度，D-101大孔吸附树脂洗脱液的最佳浓度为50%的乙醇。

3.6 确定最佳洗脱流速

通过2.5.3和2.6.3的实验方法得到以下结果。

图3 洗脱液不同流速的吸光度Fig.3 Eluentabsorbanceat different flow speed

由图3可知吸光度随着流速的增加而减小，也就是洗脱率随着流速的增加而减小，但是当流速为0.5mL/min和1.0mL/min时，这两种树脂洗脱液的吸光度均没有变化，并都在最高值，考虑到流速过慢，会影响实验进程和生产效率，所以最佳流速选择1.0mL/min。

3.7 选择洗脱体积

通过2.5.4和2.6.4的实验方法得到以下结果。

图4 两种树脂洗脱体积Fig.4 Two resinselution volume

由图4计算得AB-8大孔吸附树脂洗脱液体积为49.3mL，D-101大孔吸附树脂洗脱液体积为53.3mL。在试验中为使多糖尽量洗脱下来，所以选择AB-8大孔吸附树脂洗脱液体积为10 BV体积，D-101大孔吸附树脂洗脱液体积为10.5BV。

3.8 玉竹多糖纯化

通过2.7的实验方法测得吸光度见表2、表3。

表2 洗脱液的吸光度Table2 Eluentabsorbance

表3 烘干物质量Table3 Drym atterm ass

通过两种树脂对玉竹多糖的纯化，AB-8大孔吸脂使玉竹多糖的纯度达到78.64%，D-101大孔树脂使玉竹多糖的纯度达到73.79%。

3.9 玉竹多糖最佳纯化工艺

通过以上实验结果得出AB-8的最佳分离工艺为最佳上样浓度为1.0mg/mL，最佳洗脱浓度为75%乙醇，最佳流速为0.5mL/min，但是0.5mL/min流速于1.0min/mL的吸光度相差不大，但是流速过慢，影响实验进程和生产效率，所以最佳流速选择1.0mL/min。最佳洗脱液体积为10BV体积，纯度从65.23%提高到78.64%；D-101的最佳分离工艺为最佳上样浓度为0.6mg/mL，最佳洗脱浓度为50%乙醇，最佳流速为1.0 mL/min，最佳洗脱液体积为10.5 BV，纯度从65.23%提高到73.79%。所以AB-8大孔吸附树脂对玉竹多糖的分离效果要优于D-101大孔吸附树脂。

4 结论

一般多糖的纯化比较复杂，本实验采用大孔吸附树脂对玉竹多糖进行初步纯化的研究，玉竹多糖纯度达78%以上。结果表明大孔吸附树脂可以用于玉竹多糖的纯化，对玉竹多糖纯化方法具有创新性，对其它多糖类物质精制除杂也有重要参考价值。从本文试验结果看，样品液经过选用的两种型号大孔吸附树脂柱，玉竹多糖纯度均有明显提高。

其中AB-8型大孔吸附树脂提高近13%，玉竹多糖纯度达到78.64%，最佳分离工艺为：上样浓度为1.0mg/mL，洗脱浓度为75%乙醇，流速为0.5mL/min，但是0.5mL/min流速与1.0min/mL的吸光度相差不大，但是流速过慢，影响实验进程和生产效率，所以最佳流速选择1.0mL/min。最佳洗脱液体积为10 BV体积；D-101型大孔吸附树脂纯度提高近8%，玉竹多糖纯度达到73.79%，而且玉竹多糖过柱得收率较高。最佳分离工艺为：上样浓度为0.6mg/mL，洗脱浓度为50%乙醇，流速为1.0mL/min，洗脱液体积为10.5 BV。因此，对玉竹多糖进行纯化时，AB-8大孔吸附树脂对玉竹多糖的分离效果优于D-101大孔吸附树脂，本文对玉竹多糖及其多糖类制剂开发有实际意义。

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Isolation&Purification of Polysaccharide from Polygonatum odoratum by AB-8 and D-101 M acroporous Adsorption Resins

YANGBo1，HANFeng-bo1，YANGBo2

（1.Jilin Agriculture Science and Technology College，Jilin 132101，Jilin，China；2.Taonan Integrated Test Station，Jilin Academy of Agricultural Science，Taonan 137100，Jilin，China）

Glucose is used as standerd in the experiment.AB-8macroporous adsorption resin to extract and purify polysaccharide of polygonatum odoratum.The best condition of extracting and purifying polygonatum odoratum，the best concentration for sampleswas 1.0mg/mL，the bestelution concentration was 75 percentof ethanol，the bestvelocitywas1.0mL/min，and the elution liquid volumewas10 BV.The purification degree of crude polysaccharid in polygonatum odoratum increased from 65.23%to 78.64%.However，using D-101 macroporousadsorption resin toextractand purifypolysaccharideof polygonatum odoratum.Thebestcondition of extracting and purifying polygonatum odoratum，the best concentration for samples was 0.6 mg/mL，the best elution concentrationwas50 percentofethanol，the bestvelocitywas1.0mL/min，and the elution liquid volume was10.5BV.Thepurification degreeofcrude polysaccharid in polygonatum odoratum increased from 65.23%to 73.79%.The resultshowed that the effectofextracting and purifying polysaccharide of polygonatum odoratum with AB-8macroporousadsorption resinwasbetter than D-101macroporousadsorption resin.

Polygonatum odoratum polysaccharide；purification；AB-8macroporousadsorption resin；D-101 macroporousadsorption resin

2014-07-18

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.23.018

吉林省科技项目（20130303093）

杨波（1979—），男（汉），讲师，博士，主要从事园林植物的教学及研究工作。