柱前衍生化-高效液相色谱法测定啤酒中的多胺

王利娜，金东日

(延边大学理学院 化学系，吉林 延吉 133002)

多胺是一类广泛存在于生物体内的有机小分子物质，主要包括腐胺(PUT)、尸胺(CAD)、精眯(SPD)和精胺(SPM)等，它与细胞分化、增殖、发育有关，并能影响DNA、RNA和蛋白质的代谢.食物是人体内多胺的重要来源之一[1]，研究表明，多胺水平与肿瘤发生、发展存在一定相关性[2]，因此如何准确而快速地检测出食物中多胺的含量具有重要意义.传统的多胺检测方法[3]主要采用氨基酸分析仪和纸电泳法，但这两种方法存在样品回收率低、检测灵敏度不高的问题.目前多胺的检测多采用衍生化的方法，即将多胺的氨基接在对荧光或紫外有吸收的基团上，再通过液相色谱分离检测.Tang等[4]人采用4-氯-3,5-二硝基三氟甲苯作为衍生化试剂，用HPLC-UV检测了啤酒中的多胺，但此方法分析时间较长，灵敏度较低.文献[5]用衍生化试剂1-(5-氟-2,4-二硝基苯基)-4-甲基哌嗪(PPZ)建立了分析啤酒中多胺含量的高效液相色谱法，本文依据文献[5]的方法，对啤酒中多胺含量的测定进行研究.

1 实验部分

1.1 仪器和试剂

仪器有Shimadzu LC-6A系列液相色谱仪，UV检测器，N2000色谱软件(浙江大学)，U-3100紫外-可见分光光度仪(Shimadzu)，Agilent HPLC-6410三重串联四级杆质谱仪.

1-(5-氟-2,4-二硝基苯基)-4-甲基哌嗪(PPZ)、1,6-己二胺(DAH)、1,3-丙二胺(DAP)、腐胺(PUT)为梯希爱(上海)化成工业发展有限公司产品，尸胺(CAD)为百灵威科技公司产品，亚精胺(SPD)和精胺(SPM)为Sigma-Aldrich公司产品，乙腈为色谱纯，水为超纯水，6种不同品牌啤酒购于延吉市的超市.

1.2 色谱条件

色谱柱为Diamonsil C18(2)(迪马，150 mm×4.6 mm，3 μm)，流动相为水-有机溶剂(乙腈-甲醇,体积比为6∶4)，紫外检测波长为362 nm，流速为0.5 mL/min，柱温为25 ℃，进样量为10 μL，梯度洗脱程序如表1所示.

表1 梯度洗脱程序

1.3 LC-MS

MS条件：ESI离子源，正离子模式，干燥气温度为300 ℃，干燥气流量为3 L/min，雾化器压力为15 psi，毛细管电压为4 000 V，质量范围为200～1 300 Da.色谱条件同1.2.

1.4 试液

取PPZ(20.2 mg)溶解于1 mL乙腈溶液中，配成浓度为71.1 mmol/L的储备液，于4 ℃保存，临用前稀释.取适量DAD、CAD、PUT、SPD和SPM，分别加1 mL超纯水溶解，再加10 mmol/L硼砂溶液使各多胺浓度均为5 mmol/L.取DAH 11.6 mg，加1 mL超纯水溶解，再加10 mmol/L硼砂溶液使DAH浓度为30 μmol/L.

1.5 衍生化反应

分别取7.0 mmol/L PPZ和50.0 μmol/L多胺溶液各150 μL置于聚丙烯管中，搅拌2 min后于60 ℃条件下反应50 min.反应液冷却后，过0.22 μm膜，取滤液10 μL进样.

1.6 样品处理

用0.45 μm滤膜过滤啤酒样品，然后用0.1 mol/L硼砂溶液稀释啤酒滤液1倍.向啤酒稀释液加适量DAH后，按1.4衍生化反应方法进行衍生化.

2 结果与讨论

2.1 紫外波长的选择

PPZ紫外吸收光谱如图1所示.PPZ在196 nm和362 nm波长处有明显的紫外吸收峰，且362 nm处的吸光度最大，其摩尔吸光系数εmax=1.62×104，因此本实验以362 nm为检测波长.

图1 PPZ紫外吸收光谱图

2.2 衍生化反应及其条件

以CAD为例说明衍生化试剂PPZ与多胺的衍生化反应(图2).此反应在硼砂介质中进行，生成CAD -PPZ衍生物([M+H]+=631.4，见图3)，其衍生物在4 ℃条件下能保存3 d以上.碱性介质及其浓度、衍生化试剂用量、反应温度和时间都对衍生化反应产生重要影响.由于在前期研究中已确定了该衍生化反应的最佳条件[5]，因此本文直接采用该条件进行衍生化.

图2 PPZ与CAD衍生化反应

图3 CAD衍生物的MS谱图

2.3 色谱分离

在Diamonsil C18(2)色谱柱上考察水-乙腈、水-甲醇、水-乙腈-甲醇等不同流动相体系中多胺衍生物的分离效果.在以水-乙腈为流动相时，多胺衍生物的色谱流出顺序大体为DAP、PUT、CAD、SPD、DAH和SPM，其保留时间随着流动相中乙腈含量的增加而减少.当流动相水-乙腈的体积比为40∶60时，SPD和SPM的保留时间较长(>30 min)，且SPM峰拖尾现象严重(见表2)；当流动相水-乙腈的体积比为10∶90时，DAP和PUT衍生物峰与PPZ峰重叠，但SPM拖尾情况未能得到改善；当流动相水-乙腈的体积比为30∶70或20∶80时，仍未能实现6种多胺的同时分离.在以水-甲醇为流动相时，当流动相中甲醇含量超过85%时，多胺流出顺序为DAP、PUT、SPD、CAD、SPM和DAH.当以水-甲醇(体积比为10∶90)作为流动相时，虽然SPM拖尾情况得到改善，但在梯度洗脱条件下仍无法实现6种多胺的同时分离.因此，本文采用水-甲醇-乙腈作为流动相，用梯度洗脱方法对6种多胺衍生物进行同时分离试验.在梯度洗脱程序设计中，当流动相中有机相起始浓度高(>78%)时，DAP与PUT峰没有分离，有机相起始浓度低(<78%)时，出现不对称的SPD和SPM峰；因此，流动相中有机相起始浓度选为78%.在乙腈和甲醇混合有机相中，随着乙腈含量的增加，分析时间缩短.当有机相组成由2∶8(体积比)变换为4∶6(体积比)时，分析时间从35 min缩短到21 min.当有机相中乙腈为70%时，CAD和SPD峰有部分重叠.经过试验最后确定有机相的乙腈-甲醇体积比为6∶4.梯度洗脱程序如表1所示.在此梯度洗脱条件下，6种多胺衍生物达到基线分离，如图4所示.

表2 多胺衍生物在不同乙腈浓度中的保留时间

图4 PPZ空白色谱图(a)和多胺衍生物色谱图(b)

2.4 分析方法的评价

前期研究[5]中已报道了本文方法的线性回归方程、线性范围、最低检出限、稳定性等.

2.5 方法回收率

向啤酒中加入一定量的多胺和内标物(DAH)，按样品处理方法处理，衍生化后直接进行分析并根据线性回归方程计算测定值回收率.结果如表3所示，多胺回收率在93.1%～105.8%范围内.

表3 方法回收试验

2.6 啤酒中多胺的测定

取前处理的啤酒样品，按照1.2和1.5进行实验.典型的啤酒多胺色谱图如图5 a所示，采用标准加入法对各峰进行确证的结果如图5 b所示.6种不同品牌啤酒中多胺含量见表4.有些样品中未能检测到多胺的浓度，其原因可能是多胺的浓度低于本方法的检出限.

图5 啤酒中多胺的色谱(a)和标准加入法确证色谱图(b)

表4 啤酒中多胺含量的测定

3 结论

本文将PPZ作为衍生化试剂与多胺反应，该衍生化反应条件温和，生成的多胺衍生物较为稳定.在常规ODS色谱柱和UV检测器条件下，可同时分离、检测多种多胺化合物，其检测灵敏度较高，准确度好，分析速度快.本方法可用于生物样品和食品中多胺含量的检测.

参考文献：

[1]吉晓佳，张大栋，刘友良,等.植物源食品多胺的作用及其调控[J].植物学通报，2002，19(4)：504-509.

[2]Anthony E. Recent advances in the biochemistry of polyamines in eukaryotes[J]. Biochem J,1986,234(2):249-262.

[3]Nikolaus S. Thin-layer Chromatography and Thin-layer Electrophoresis of Polyamines and Their Derivatives[M]. New York: Academic Press,1983:3-9.

[4]Tang T,Shi T,Qian K,et al. Determination of biogenic amines in beer with pre-column derivatization by high performance liquid chromatography[J]. J Chromatogr B,2009,877(5-6):507-512.

[5]Jin D,Wang L,Lee Y. Determination of the polyamines in human nails as 1-(5-fluoro-2,4-dinitrophenly)-4-methlypiperazine derivatives using high performance liquid chromatography[J]. Microchem J,2013,110:568-574.