CpG ODN对胰腺癌细胞PANC1吉西他滨化疗敏感性的影响

吴汉青 王博 薛寅凯 郑海 陈立波 吴河水

吉西他滨是临床上抗胰腺癌的一线化疗药物。吉西他滨与生物靶向药物联用以提高疗效和降低毒性反应是近年来研究的热点。Toll样受体9(Toll-like receptor，TLR9)于2000年被首次成功克隆，配体为非甲基化胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸序列的DNA(CpG DNA)[1]。目前发现TLR9不仅表达于免疫细胞，还表达于多种肿瘤细胞，并且TLR9信号的活化与肿瘤细胞的增殖、凋亡、侵袭、转移以及耐药性等密切相关[2]。本研究应用TLR9激动剂CpG ODN2216干预胰腺癌PANCl细胞株，观察其对胰腺癌细胞增殖及对吉西他滨敏感性的影响，探讨提高胰腺癌化疗效果的可能途径。

材料与方法

一、材料

人胰腺癌细胞PANC1由华中科技大学同济医学院附属协和医院普外实验室提供，常规培养、传代。CpG ODN2216序列为5′-GGGGGACGATCG-TCGGGGGG-3′，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，全硫代磷酸化修饰，PAGE纯化。兔抗人TLR9单抗购自美国cell signaling公司。免疫荧光试剂盒购自武汉博士德公司。四甲基偶氮唑蓝(MTT)及二甲基亚砜(DMSO)购自美国sigma公司。注射用盐酸吉西他滨购自法国Lilly公司。

二、免疫荧光化学法

用胰酶消化PANC1细胞，制成单细胞悬液，滴到玻片上，常规培养24～36 h。取出爬片，PBS漂洗3次，每次5 min；用4%的多聚甲醛固定15 min，PBS再漂洗3次；用0.5%Triton穿孔20 min，再用PBS漂洗3次后用5%BSA封闭30 min。甩干液体后，加入稀释的TLR9单抗，用PBS代替一抗作为对照。4℃孵育过夜后PBS漂洗3次，加入稀释的二抗置37℃孵育1 h，PBS漂洗3次后加入稀释的SABC-FITC，置37℃继续孵育30 min。用PBS漂洗3次，水溶性封片剂封片，荧光显微镜下观察。

三、蛋白质印迹法

收集对数生长期的细胞，用预冷的PBS洗涤细胞2次。……