吉西他滨对Beclinl基因沉默的人胰腺癌MiaPaCa-2细胞的周期及凋亡的影响

李宏宇 李晓姝 王立生 杨月峰 郭晓钟

胰腺癌的发生、发展及转移与其细胞生物学的调控有关，并与细胞坏死、凋亡及自噬存在密切联系。Beclin1基因参与细胞自噬的调控，在肿瘤形成及发展过程中具有重要作用[1-3]。研究提示，胃癌、前列腺癌、乳腺癌等多种肿瘤细胞存在Beclin1自噬基因的缺陷，导致了肿瘤细胞逃避自噬性死亡，且发现某些抗肿瘤药物可能通过自噬机制在肿瘤治疗方面发挥作用，但在胰腺癌方面尚缺乏相关的研究报道。吉西他滨是目前用于治疗胰腺癌的一线药物。本研究观察吉西他滨对Beclin1基因沉默的人胰腺癌细胞系MiaPaCa-2细胞周期及凋亡的影响，为胰腺癌的基因治疗提供一定的实验基础。

材料与方法

一、质粒的构建及细胞转染

根据siRNA设计原理，由上海吉玛制药技术有限公司合成3条靶向Beclin1基因的siRNA(siBecl)、阴性对照siRNA(siNC)及荧光标记的siRNA(siFAM)。筛选干扰效果最好的siBecl序列构建表达质粒U6/Neo-siBec1、阴性对照质粒pGPU6/Neo-siNC及荧光对照质粒pGPU6/GFP/Neo-siFAM。载体由上海吉玛制药技术有限公司构建。

人胰腺癌细胞系MiaPaCa-2由军事医学科学院提供，常规条件下培养、传代。取对数生长期细胞，采用Lipofectamin2000(Invitrogen 公司)将3种质粒分别转染细胞。先瞬时转染，48 h，再在培养上清液中加入400 μg/ml的G418筛选稳定转染细胞，3～4 d，换含G418的培养液一次，18 d后收集细胞，提取蛋白，置-20℃冰箱保存。

此外，转染siBecl的MiaPaCa-2细胞的培养液中加入0.4 μg/ml吉西他滨(法国礼来公司)继续培养24 h，以未加吉西他滨处理的转染siBecl的MiaPaCa-2细胞作为对照。

二、Beclin1蛋白和mRNA表达的检测

采用常规蛋白质印迹法检测Beclin1蛋白表达，以β-actin作为内参。……