大黄鱼消化系统的组织学和组织化学研究

崔龙波,迟 爽,李新华,韩 涛,李 倩,赵振军,马家好

(1.烟台大学生命科学学院,山东 烟台 264005;2.海丰水产技术服务部,福建 宁德 352100;3.利洋水产科技有限公司,广东 广州 518518)

大黄鱼(Pseudosciaenecrocea)主要分布于中国黄海南部、东海、南海等海域,是我国重要海水经济鱼类之一．我国大黄鱼繁育及养殖技术处于世界领先地位,苗种数量、养殖规模和成鱼产量都居世界之首,2008年全国养殖大黄鱼产量达65 977 t[1]．鱼类对食物的消化和吸收是直接关系其生长、发育和繁殖的重要生命活动,因此随着大黄鱼养殖业的迅速发展,对其消化系统的研究更具迫切性．林树根等[2]研究了大黄鱼消化道器官的显微与亚显微结构,朱爱意和褚学林[3]检测了大黄鱼消化道不同部位两种消化酶的活力分布,徐晓津等[4]对大黄鱼消化系统的胚后发育进行了组织学研究．为了确定合理的饲养技术措施,国内外学者对鱼类消化系统结构、功能及消化酶的分布与特性进行了比较深入和系统的研究,并随着技术的发展逐步由形态学研究深入到组织化学和细胞学等研究领域[5-7]．本研究中,作者以组织学及组织化学技术为研究手段,对大黄鱼的消化系统进行研究,旨在了解大黄鱼摄食、消化和吸收的生理机制,并为大黄鱼配合饵料研制及优化养殖提供理论依据．

1 材料与方法

1.1 材料

健康正常的大黄鱼于2011年1月取自福建宁德大黄鱼养殖区,试验个体14月龄,共8尾鱼,雌雄各半．解剖取出消化系统各器官后进行以下研究．

1.2 方法

1.2.1 组织学研究 采集的各器官组织块于Bouin氏液固定,石蜡包埋切片,切片厚5～6 μm,苏木精-伊红(H.E)染色．

1.2.2 组织化学研究 根据染色方法的不同,各组织块分别置于Bouin氏液或Gendre氏液固定,石蜡包埋切片,切片厚5～7μm,分别进行如下染色:PAS反应显示多糖,唾液消化后PAS反应显示糖原,Alcian蓝-PAS反应显示中性与酸性粘多糖．另取各器官新鲜组织块直接于恒冷冰冻切片机上切片,切片厚6～10 μm,分别进行如下染色:Cunnigham氏明胶薄膜法显示蛋白酶,Gomori氏吐温(40和80)法显示脂酶,酸性乙酸-α-萘酯-六偶氮对品红法显示非特异性酯酶,Gomori氏钙钴法显示碱性磷酸酶,以及Gomori氏硝酸铅法显示酸性磷酸酶．

以上组织化学研究方法见文献[8]．

2 结 果

大黄鱼消化系统由消化道和消化腺组成,消化道包括口、胃、幽门盲囊、肠和肛门,消化腺包括肝脏和胰腺．

2.1 组织学研究

2.1.1 胃 胃是大黄鱼消化道最发达、管壁最厚的部分,可以分为胃前、胃中和胃后3段,但3段之间无明显界限．胃壁横切面从内向外由粘膜、粘膜下层、肌层及外膜构成,粘膜又可分为上皮、固有层和粘膜肌层．在胃前段,粘膜上皮除单层柱状细胞外,还有许多体积较大的粘液细胞(图1a);固有层与粘膜下层连续在一起,为疏松结缔组织,无粘膜肌层;肌层为骨骼肌;外膜为疏松结缔组织．在胃中和胃后段,胃粘膜形成大的纵行皱襞,粘膜表面有许多胃小凹,由上皮内陷而成．粘膜上皮主要为单层柱状细胞,细胞核椭圆形,位于细胞基底部．固有层较厚,含有发达的胃腺,胃腺为单管状腺,腺管平行排列,开口于胃小凹处．胃腺上皮由2种细胞构成,Ⅰ型细胞较少,仅位于胃腺的颈部,与粘膜上皮相连,细胞呈矮柱状,胞质染色较浅;Ⅱ型细胞为胃腺上皮的主体,细胞呈立方状,胞质染色较深(图1b)．有环形平滑肌组成的粘膜肌层,粘膜下层为很厚的疏松结缔组织,肌层由内环肌、外纵肌2层平滑肌组成,纵肌层较厚．

2.1.2 幽门盲囊与肠 大黄鱼在胃中部与肠相连的部位发出十余个细小的盲管,类似香蕉状,此为幽门盲囊．肠从胃中部向后发出,在腹腔内纵向形成2个回折止于肛门．幽门盲囊与肠的组织学结构基本一致,管壁均由粘膜、粘膜下层、肌层和外膜层构成．幽门盲囊和肠管内壁形成发达的皱襞和绒毛(图1c),幽门盲囊的绒毛长而相互交联成网状,但肠后段皱襞和绒毛数目逐渐减少．粘膜上皮主要为纹状缘发达的单层柱状细胞,其间分布较多的粘液细胞．在幽门盲囊和肠壁内未见肠腺．

2.1.3 肝脏 肝细胞排列成不规则的索状,肝细胞索之间的空隙为肝血窦(图1d)．肝细胞体积较大,细胞核大而圆,有1个或2个核仁,细胞质丰富．中央静脉和小叶间组织不明显,有散在的胆管．

2.1.4 胰腺 大黄鱼胰腺为弥散性腺体,除少量散在于肝组织外,主要分布在胃、肠周围．胰腺为复管泡状腺,胰腺细胞呈柱状或锥形,胞质基底端嗜碱性,游离端含有嗜酸性酶原颗粒,或排空呈空泡状,核仁明显(图1e)．胰腺组织内有大小不等的黑色素巨噬细胞中心．

2.2 组织化学研究

2.2.1 PAS反应 胃前段、幽门盲囊与肠粘膜粘液细胞的细胞质,胃腺Ⅰ型细胸的细胞质,以及肝细胞质中的颗粒呈紫红色,表明含多糖类物质(图1f)．

2.2.2 唾液消化后PAS反应 肝细胞质中颗粒的紫红色消失,表明肝细胞含有糖原．

2.2.3 Alcian蓝-PAS反应 胃前段粘膜粘液细胞及胃腺Ⅰ型细胞的细胞质呈紫红色，表明含中性和酸性混合粘液物质(图1g).幽门盲囊与肠粘膜粘液细胞的细胞质呈蓝色，表明含酸性粘液物质(图1h).

2.2.4 明胶薄膜法 胃中后端胃腺Ⅱ型细胞的游离端、幽门盲囊及肠粘膜柱状细胞的游离端呈透明空斑，表明具蛋白酶活性，其中胃腺Ⅱ型细胞和肠后段粘膜柱状细胞的蛋白酶活性最强(图1i,j).肝细胞的游离端及胰腺细胞游离端的酶原颗粒呈现弱阳性(图1k).

2.2.5 吐温法 胃中后段、幽门盲囊及肠粘膜柱状细胞的游离端有棕色颗粒,表明具脂酶活性(图1l)．

2.2.6 酸性乙酸-α-萘酯-六偶氮对品红法 胃、幽门盲囊和肠粘膜柱状细胞的游离端细胞质、肝细胞细胞质及胰腺细胞游离端的酶原颗粒呈红棕色,表明具非特异性酯酶活性(图1m,n)．幽门盲囊和肠粘膜柱状细胞的非特异酯酶活性强于其它部位的细胞．

2.2.7 钙钴法 幽门盲囊和肠粘膜柱状细胞的游离端质膜呈黑色,表明具碱性磷酸酶活性(图1o)．

2.2.8 硝酸铅法 幽门盲囊和肠粘膜柱状细胞游离端有棕褐色颗粒,表明具酸性磷酸酶活性(图1p),其中肠后段粘膜柱状细胞的酸性磷酸酶活性最强．

3 讨 论

鱼类的食性与其消化系统的组织结构和消化机能密切相关．本研究表明,大黄鱼消化系统各器官的组织结构不同,消化酶的种类和活性也呈明显的差异,由此承担不同的消化与吸收机能．

(a)胃前段(H.E) ; (b)胃后段(H.E); (c)肠(H.E); (d)肝脏(H.E); (e)胰腺(H.E); (f)肠(PAS反应); (g)胃后段(Alcian蓝-PAS反应); (h)肠(Alcian蓝-PAS反应); (i)胃后段(明胶薄膜法); (j)肠后段(明胶薄膜法); (k)肝脏(明胶薄膜法); (l)肠(吐温40法); (m)胃后段(酸性乙酸-α-萘酯-六偶氮对品红法) ;(n)幽门盲囊(酸性乙酸-α-萘酯-六偶氮对品红法); (o)肠(钙钴法); (p)肠(硝酸铅法)C. 柱状细胞; H. 肝细胞; L. 胃(肠或幽门盲囊)腔; M.粘液细胞; P. 胰腺细胞; S. 粘膜下层; Ⅰ. 胃腺Ⅰ型细胞; Ⅱ. 胃腺Ⅱ型细胞; 标尺=70 μm

胃是大黄鱼消化道最膨大的部分，能容纳较多的食物，也是进行消化作用的重要场所.大黄鱼胃中后段具有发达的胃腺，胃腺上皮由Ⅰ型细胞和Ⅱ型细胞两种细胞构成，组织化学研究显示Ⅱ型细胞呈现很强的蛋白酶活性，与大菱鲆Scophthalmusmaximus胃腺细胞的组成与功能相似[5].电镜观察显示大黄鱼胃腺细胞是一种典型的泌酸胃酶细胞，在细胞内含有相当多的微管泡系和酶原颗粒[2].不同的消化酶在鱼类各消化器官内的分布存在差异，消化酶活力是反映鱼类消化生理机能的一项重要指标，其高低决定鱼类对营养物质消化吸收的能力，而大黄鱼蛋白酶活力在各消化器官中以胃最强[3].大黄鱼胃腺Ⅰ型细胞即林树根等[2]观察到的粘液腺，组织化学研究显示它与胃前段粘膜粘液细胞一样分泌中性和酸性混合粘液物质，这些粘液物质可保护胃粘膜免受盐酸和胃酶的消化作用[9].

幽门盲囊是肉食性鱼类特有的消化器官[10],有些鱼类的幽门盲囊中不仅存在较强的消化酶活性,而且还具有强大的消化功能[11]．本研究显示大黄鱼幽门盲囊的组织结构和酶的种类与肠基本相同,表明二者的功能是一致的．肠道对食物的消化、吸收主要与粘膜表面结构和肠道的分泌能力有关[12]．大黄鱼幽门盲囊与肠粘膜形成许多纵行皱襞,皱襞上又有许多分支肠绒毛,粘膜柱状细胞又有发达的纹状缘,这些都有效扩大了粘膜与食物接触的消化与吸收面积．在本研究所检测的消化酶中,幽门盲囊与肠所含酶的种类最多,表明幽门盲囊与肠在大黄鱼消化与吸收方面的作用非常重要．

大黄鱼幽门盲囊与肠粘膜柱状细胞蛋白酶的活性仅次于胃腺．一般认为鱼类对食物的消化主要发生在胃、幽门盲囊和肠的前部,大多数鱼类肠道中的消化酶活性由前段向后段呈现递减趋势．Tengjaroenkul等[7]研究了罗非鱼0reochromisniloticus消化酶的分布模型,表明肠道末端基本上没有酶活性(包括淀粉酶、肽酶、脂酶和蛋白酶等)．然而,本研究却显示大黄鱼肠后段蛋白酶的活性强于肠前段和中段,体外对蛋白酶活力的研究也证实这一点[3],表明大黄鱼肠后段仍然具有很强的消化能力．在对4种鲇形目鱼消化酶的研究中,发现肠道是各消化区段中消化脂肪的主要部位[13],并且脂肪酶活性与鱼摄食的食物脂肪含量呈正相关关系[10]．本研究表明,大黄鱼仅幽门盲囊与肠粘膜柱状细胞具有脂肪酶活性．

已在几种鱼发现非特异酯酶参与类脂的消化[14]和类脂的吸收[15]．因在肠上皮细胞中观察到含有类脂的囊泡,一般认为肠与类脂吸收密切相关[16]．由于鱼以类脂而非碳水化合物和蛋白质作为其主要营养来源,所以非特异酯酶的存在对鱼类可能更重要[14]．与欧洲无须鳕Merlucciusmerluccius一样[6],大黄鱼对羧基酯的水解主要发生在幽门盲囊和肠,因为幽门盲囊和肠粘膜柱状细胞的非特异酯酶活性强于其它部位的细胞．

碱性磷酸酶主要见于发生活跃转运的细胞膜,它参与吸收过程,因此被认为是营养吸收的标志物[17]．消化酶作用产生的小的多肽和氨基酸可以借助碱性磷酸酶和ATP酶的共同作用穿过细胞膜[15,18]．因此,存在碱性磷酸酶活性的大黄鱼幽门盲囊和肠发挥着重要的吸收作用．已有研究表明大菱鲆Scophthalmusmaximus肠上皮细胞能够通过胞饮作用和细胞内消化来加工摄入的外源性食物[19],林树根等[2]在大黄鱼肠上皮细胞胞质上方观察到散在分布的溶酶体,本研究中显示大黄鱼幽门盲囊与肠柱状细胞呈现酸性磷酸酶活性,而酸性磷酸酶是溶酶体的标志酶,因此大黄鱼幽门盲囊与肠柱状细胞可通过胞吞作用,在溶酶体的参与下进行细胞内消化,从而实现营养物质的吸收．

肝脏是鱼类最大的消化腺体,具有分泌、解毒、储存等作用[10]．大黄鱼胰腺为弥散性腺体．在本研究所检测的消化酶中,大黄鱼肝细胞和胰腺细胞表现出弱的蛋白酶活性及非特异性酯酶活性．此外,肝胰脏还是淀粉酶生成的主要器官,它分泌机能的强弱直接影响鱼类对食物中淀粉的消化能力[3,20]

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