野生及栽培苜蓿种质资源遗传多样性的同工酶分析

陈立强，师尚礼，马春晖

(1．塔里木大学动物科学学院，塔里木畜牧科技兵团重点实验室，新疆 阿拉尔 843300；2．甘肃农业大学草业学院，甘肃 兰州 730070； 3.石河子大学动物科技学院，新疆 石河子 832000)

野生及栽培苜蓿种质资源遗传多样性的同工酶分析

陈立强1，师尚礼2，马春晖3

(1．塔里木大学动物科学学院，塔里木畜牧科技兵团重点实验室，新疆 阿拉尔 843300；2．甘肃农业大学草业学院，甘肃 兰州 730070； 3.石河子大学动物科技学院，新疆 石河子 832000)

采用过氧化物酶、淀粉酶、过氧化氢酶电泳技术，对两份野生紫花苜蓿(Medicagosativa)种质资源和27份栽培苜蓿品种的遗传多样性进行分析。结果显示，3种同工酶共检测到30条稳定酶带，其中6条为特异酶带，出现在陇东野生紫花苜蓿、拜城野生紫花苜蓿、兰杰兰德和大西洋紫花苜蓿酶谱中。过氧化物酶、过氧化氢酶和淀粉酶的多态位点百分率分别为75.00%、55.56%和33.33%。29份苜蓿材料间的相似系数介于0.633～1.000，平均值为0.867，两份野生紫花苜蓿种质资源与栽培品种间的相似系数相对较小，栽培品种间的相似系数相对较大。聚类分析表明，在相似系数0.772处可将29份苜蓿材料聚为3类，第1和第2类分别由陇东野生紫花苜蓿和拜城野生紫花苜蓿单独组成。陇东野生紫花苜蓿和拜城野生紫花苜蓿在主成分分析图中的位置也相对孤立，表现出野生种质资源与栽培品种间较远的亲缘关系。

苜蓿；野生种质资源；栽培品种；同工酶；遗传多样性

紫花苜蓿(Medicagosativa)起源于小亚细亚、外高加索、伊朗和土库曼高地，产量高、品质好、营养丰富、适口性好，被誉为“牧草之王”，是世界上栽培面积最广，最主要的豆科牧草之一[1-2]。20世纪末，我国苜蓿种植面积达200万hm2，居世界第5位。近年来，特别是受2008年三聚氰胺事件的影响，苜蓿在奶业安全发展中的重要性突出体现，种植面积逐年扩大[3-4]。遗传多样性是确保物种延续和不断进化的关键，开展苜蓿遗传多样性研究，对扩大品种的遗传基础和选育新品种均有重要作用。

目前，国内外在苜蓿遗传多样性方面做了大量工作，已从形态学水平[5]、细胞学水平[6]、生理生化水平[7]、分子水平[8]对苜蓿种质资源遗传多样性进行了研究，所涉及的苜蓿属植物包括紫花苜蓿[9]、杂花苜蓿(M.varia)[10]、黄花苜蓿(M.falcata)[11]、天蓝苜蓿(M.lupulina)[12]、扁蓿豆(M.ruthenica)[13]、南苜蓿(M.polymorpha)[14]、蒺藜苜蓿(M.truncatula)、蜗牛苜蓿(M.scutellata)、刺球苜蓿(M.sphaerocarpos)及海滨苜蓿(M.littoralis)[15]等，研究对象也包含了品种[16]、品系[17]、居群[18]、野生资源[19]等。各研究采用不同的方法对苜蓿材料间的遗传关系进行了分析，取得了丰硕的成果，为苜蓿种质资源研究、保护和利用提供了科学依据，但苜蓿种质资源种类多、数量大、分布广，目前各研究所涉及的材料都非常有限。近年来，随着苜蓿种质资源数量的急剧增加，特别是野生种质资源、育成品种和引进品种的不断增加，苜蓿遗传多样性研究需要不断补充，为苜蓿育种提供依据。

同工酶是基因表达的产物，其蛋白多肽链结构中的氨基酸排列顺序是由DNA上结构基因所携带的遗传信息所决定的，通过酶谱分析，就能识别控制这些谱带表达的基因，从而从本质上揭示材料间的遗传差异[20]。自1972年Miller首次用同工酶技术鉴定了苜蓿杂交种之后，目前该技术已广泛地应用于苜蓿遗传多样性检测[21-22]。本研究采用过氧化物酶、过氧化氢酶、淀粉酶对两份野生紫花苜蓿种质资源和27份栽培苜蓿品种的遗传多样性进行检测，以期为进一步开展苜蓿品种遗传改良、杂交亲本选配以及野生种质资源的利用提供依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

试验材料包括野生紫花苜蓿材料两份，栽培品种27份(表1)。陇东野生紫花苜蓿分布于甘肃清水半阴湿山脚地带，与栽培紫花苜蓿相比，其根系具有根茎，水平或斜生，无主根，茎细且硬，抗寒抗旱，耐牧，有许多栽培苜蓿所不具有的植物学和生物学特征[23]。拜城野生苜蓿分布于新疆拜城，具有发达的根系，匍匐生长，与栽培品种相比，具有明显的株高优势。

1.2 方法

1.2.1 酶液的提取 淀粉酶(AMY，EC 3.1.1.1)和过氧化氢酶(CAT，EC 1.11.1.6)从种子中提取，用浸泡24 h的种子提取酶液；过氧化物酶(POD，EC 1.11.1.7)从发芽后第8天的幼苗中提取。随机选取40株幼苗或40粒吸涨种子，置于冰浴中研磨，并按照1 g材料加4 mL提取缓冲液的比例，陆续加入预冷的0.1 mol·L-1Tric-HCl(pH为8.0)缓冲液[24]。充分研磨后取2 mL匀浆迅速转移到2 mL离心管中，在4 ℃冷冻离心机中以8 000 r·min-1离心10 min，取上清液，加入等体积40%的蔗糖溶液制成样品液，混匀后分装于1.5 mL离心管中，置于-80 ℃冰箱中贮存备用[25]。

1.2.2 电泳及染色 本试验采用聚丙烯酰胺垂直板凝胶电泳技术，胶板厚1.5 mm。浓缩胶和分离胶浓度、凝胶配比及电极缓冲液离子强度参照周延清等[20]的配方，并做适当调整。进样量20 μL，以2%的溴酚蓝作前沿指示剂，恒压电泳，浓缩胶100 V，分离胶200 V，待指示移至玻璃板末端时停止电泳，进行剥胶，并参照张维强和唐秀芝[26]的方法进行染色，等酶谱清晰后，过氧化氢酶和淀粉酶需立即统计数据并照相，过氧化物酶凝胶需在蒸馏水中浸泡1～2 d，等酶带变成棕红色后统计数据并照相。

表1 供试苜蓿材料及原产地

1.2.3 数据处理 根据所统计酶谱带的有无，把有带计为1，无带计为0，获得“1，0”原始数据矩阵。计算各酶带的迁移率(Rf)，Rf=酶带中心的迁移距离/指示剂的迁移距离。计算各酶的多态位点百分率(Percentage of Polymorphic Bands，PPB)，PPB=(NPB/TNB)×100%，式中，NPB(Number of Polymorphic Bands)为多态性条带数，TNB(Total Number of Bands)为总条带数。采用NTSYSpc 2.1软件进行数据处理，计算供试材料间的相似系数(Genetic Similarity，GS)，GS=2Nij/(Ni+Nj)，式中，Nij为材料i和j共有的酶带数，Ni为材料i的酶带数，Nj为材料j的酶带数。利用SHAN 程序，以非加权类平均法UPGMA(Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean)进行聚类分析，并绘制相似系数树状聚类图和主成分分析图。

2 结果与分析

2.1 同工酶酶带分布特征

29份苜蓿材料的过氧化物酶共表现出12条酶带(图1)，Rf值介于0.265～0.850(表2)，其中Rf为0.350、0.430、0.600的酶带是供试材料的共有带，Rf为0.265、0.290、0.380、0.500、0.560、0.640、0.740、0.800和0.850的9条带为多态性酶带，多态位点百分率为75.00%。Rf为0.290的酶带仅出现在兰杰兰德紫花苜蓿酶谱中，Rf为0.500的酶带仅出现在陇东野生紫花苜蓿和拜城野生紫花苜蓿酶谱中，Rf为0.380、0.740、0.800和0.850的酶带在拜城野生紫花苜蓿酶谱中缺失。供试材料的过氧化氢酶共表现出了9条酶带(图2)，Rf值介于0.275～0.800(表2)，Rf为0.275、0.335、0.590和0.620的酶带为共有酶带，Rf为0.295、0.350、0.415、0.510和0.800的酶带为多态性酶带,多态位点百分率为55.56%。Rf为0.350、0.510的酶带仅出现在陇东野生紫花苜蓿酶谱中，Rf为0.800的酶带仅出现在大西洋紫花苜蓿酶谱中，Rf为0.415的酶带仅在陇东野生紫花苜蓿酶谱中缺失。淀粉酶共表现出了9条酶带(图3)，Rf值介于0.300～0.840(表2)，Rf为0.300、0.340、0.380、0.430、0.470和0.840的酶带为共有带，Rf为0.530、0.740和0.790的酶带为多态性酶带，多态位点百分率为33.33%。Rf为0.530的酶带仅出现在大西洋紫花苜蓿酶谱中。

图1 29份苜蓿材料过氧化物酶(EC 1.11.1.7)电泳图

注：图中序号与表1同。图2、图3、图4、图5、图6、表3同。

Note:Numbers of the accessions refer to Table 1. The same in Fig.2, Fig.3, Fig.4, Fig.5, Fig.6, and Table 3.

图2 29份苜蓿材料过氧化氢酶(EC 1.11.1.6)电泳图

图3 29份苜蓿材料淀粉酶(EC 3.1.1.1)电泳图

同工酶Isozyme酶代号E.C.No.酶带编号及迁移率Bandnumbersandtheirmoblities123456789101112POD1.11.1.70.2650.2900.3500.3800.4300.5000.5600.6000.6400.7400.8000.850CAT1.11.1.60.2750.2950.3350.3500.4150.5100.5900.6200.800AMY3.1.1.10.3000.3400.3800.4300.4700.5300.7400.7900.840

注：POD为过氧化物酶；CAT为过氧化氢酶；AMY为淀粉酶。

Note:POD is peroxidase; CAT is catalase; AMY is amylase.

综上，3种同工酶在29份苜蓿材料中共检测出了30条酶带，包括13条共有酶带(POD，3条；CAT，4条；AMY，6条)和17条多态性酶带(POD，9条；CAT，5条；AMY，3条)。

2.2 供试材料间的相似系数

相似系数是用来比较群体或个体间相似程度的度量参数，平均相似系数越高，说明相似程度越大，遗传背景一致性越强[27]。用NTSYSpc 2.1软件计算出供试材料间的相似系数矩阵(表3)，共获得29份苜蓿材料406对两两不同种质资源间的遗传相似系数，相似系数介于0.633～1.000，平均值为0.867，其中陇东野生紫花苜蓿与兰杰兰德间的相似系数最小(GS=0.633)，亲缘关系最远，其次是拜城野生紫花苜蓿与维多利亚(GS=0.677)，然后是陇东野生紫花苜蓿与大西洋、陇东野生紫花苜蓿与IS-1044、陇东野生紫花苜蓿与敖德萨、拜城野生紫花苜蓿与猎人河、拜城野生紫花苜蓿与大西洋、拜城野生紫花苜蓿与兰杰兰德(GS=0.700)。公农2号和牧歌401+Z间的相似系数最大(GS=1.000)，亲缘关系最近，用3种同工酶不能区分其遗传差异。栽培品种间的相似系数介于0.767～1.000，平均值为0.883，有183对栽培品种间的相似系数大于或等于0.900，亲缘关系较近，表明苜蓿栽培品种间的遗传相似性相对较高。406对材料中有47对材料间相似系数低于0.767，其中有6对材料为栽培品种，表明仍有部分苜蓿栽培品种间存在较明显的遗传差异性。陇东野生紫花苜蓿与拜城野生紫花苜蓿之间的相似系数为0.733，陇东野生紫花苜蓿与栽培品种间的相似系数介于0.633～0.833，平均值为0.749，拜城野生紫花苜蓿与栽培品种间的相似系数介于0.667～0.867，平均值为0.772。以上结果表明,野生种质资源之间以及野生种质资源与栽培品种之间存在着明显的遗传差异和较远的亲缘关系。

2.3 供试材料的聚类分析

用NTSYSpc 2.1软件对29份苜蓿材料进行聚类分析，绘出树状聚类图(图4)。结果表明，29份苜蓿材料在相似系数为0.772处可聚为3类，第Ⅰ类由陇东野生紫花苜蓿组成；第Ⅱ类由拜城野生紫花苜蓿组成；第Ⅲ类由27份栽培苜蓿品种组成，在相似系数为0.863处聚为3个亚类，第Ⅰ亚类包括陇东苜蓿、Pick8925、公农2号、牧歌401+Z、领先者、维多利亚、猎人河、IS-1044、波兰、甘农4号、德国大叶、中苜1号、会宁、甘农1号、敖德萨、美国放牧型、美国苜蓿王、渭南，第Ⅱ亚类包括Pick 3006、皇后、北极星、安格、名流、堪利普、普列洛夫卡、大西洋，第Ⅲ亚类为兰杰兰德紫花苜蓿。

2.4 供试苜蓿材料的主成分分析

通过NTSYSpc 2.1软件，对供试材料进行主成分分析，并根据第1、第2主成分作图，形成各苜蓿材料的位置分布图(图5)，图中材料间位置相互靠近者表示亲缘关系较近，远离者表示亲缘关系较远。可以看出，拜城野生紫花苜蓿和陇东野生紫花苜蓿与栽培品种间的位置较远，表明野生种质资源与栽培品种间亲缘关系较远。大西洋、兰杰兰德和渭南紫花苜蓿在图中的位置也相对孤立，表现出与其他材料间较远的亲缘关系。大部分栽培品种在图中分布于同一区域，表明栽培品种之间的亲缘关系较近。主成分分析结果与聚类分析结果基本相同。

图4 29份苜蓿材料基于3种同工酶的聚类分析图

图5 29份苜蓿材料基于3种同工酶的主成分分析图

3 讨论与结论

试验选用了3种同工酶对29份苜蓿材料进行了分析，共检测到了30条酶带，其中6条为特异酶带，出现在陇东野生紫花苜蓿、拜城野生紫花苜蓿、兰杰兰德和大西洋紫花苜蓿的酶谱中。同工酶是不同基因编码的蛋白质，是基因的直接产物[28]。因此，特异酶带是供试苜蓿材料遗传特异性的表现。多态性酶带数和百分率可以直接反映材料的多态性，间接反映酶谱的多样性信息含量，还可作为度量遗传变异水平高低的指标[29]。本研究表明，过氧化物酶、过氧化氢酶和淀粉酶的多态位点百分率分别为75.00%、55.56%和33.33%，表明供试材料具有一定的变异水平，用同工酶分析苜蓿遗传多样性时，过氧化物酶效果最佳，过氧化氢酶次之，然后是淀粉酶。马向丽和毕玉芬[22]对云南野生和逸生苜蓿资源过氧化物酶和酯酶同工酶进行了分析，过氧化物酶共检测到10条酶带，多态位点百分率为100%。李景欣等[30]对新品系Dy-2006、龙牧801、中苜1号和肇东苜蓿的酯酶和过氧化物酶进行了分析，其中过氧化物酶检测到了13条酶带，多态位点百分率为100%。尹权为等[31]采用过氧化物同工酶对12个紫花苜蓿品种的遗传多样性进行了分析，过氧化物酶检测到了9条酶带，多态位点百分率为66.70%。由于各研究所选材料不同，所得酶带数和多态位点百分率都不尽相同，但这些研究均证明过氧化物同工酶多态位点百分率较高，在苜蓿遗传多样性分析中具有良好的适用性。

29份苜蓿材料间的相似系数介于0.633～1.000，相似系数变幅较大，主要是由于野生种质资源与栽培品种之间遗传差异较大所致。野生种质资源经过长期的自然选择，保持了较为丰富的遗传多样性和适应性，往往蕴涵着育种所需要的特殊基因资源[32]。本研究表明，陇东野生紫花苜蓿与拜城野生紫花苜蓿之间相似系数为0.733，相似系数相对较小，这与关潇[33]用SRAP标记对15个国家42份野生紫花苜蓿种质资源遗传多样性的研究结果相似。陇东野生紫花苜蓿与栽培品种间的相似系数平均值为0.749，拜城野生紫花苜蓿与栽培品种间的相似系数平均值为0.772，这些值都远小于栽培品种间的平均相似系数(0.883)，聚类分析结果也显示，两份野生紫花苜蓿分别被聚在两个单独的类中，在主成分分析图中，两份野生紫花苜蓿与其他材料间位置较远，表明野生种质资源之间，以及野生种质资源与栽培品种之间的亲缘关系较远。可通过杂交、细胞融合、转基因等育种手段实现资源有利基因的结合，培育新品种。同时，由于陇东野生紫花苜蓿和拜城野生紫花苜蓿具有优良的农艺性状，可以通过鉴定、筛选、作为野生栽培品种利用，或通过驯化、选择和改良，转化为栽培品种[34]，以扩大苜蓿栽培品种的遗传基础。

27份苜蓿栽培品种间的相似系数介于0.767～1.000，平均值为0.883，其中有183对栽培品种间的相似系数大于或等于0.900。这与李景欣等[35]利用SSR标记对苜蓿新品系Dy-2006等6个苜蓿品种(品系)亲缘关系的研究结果相近。聚类分析把29份苜蓿材料在相似系数为0.722处聚为3类，栽培苜蓿品种全部聚在同一类中，在主成分分析图中，大部分栽培品种间的位置也相对较近，表现出彼此之间较近的亲缘关系。这表明，总体上栽培品种间的相似系数较大，亲缘关系较近。育种实践表明，种质资源遗传基础的宽窄、遗传多样性的丰富程度、亲缘关系的远近是育种成败的关键[34]。随着苜蓿品种遗传资源的日益枯竭，要在育种领域有所突破，一方面要重视挖掘野生种质资源、地方种质资源及具有特异优良基因的种质资源，引进和利用国外优良品种，尽量拓宽苜蓿育种材料的遗传基础；另一方面可通过远缘杂交打破种间界限，扩大基因组合范围，创造新品种。李飞飞等[18]用15对SSR引物和10个ISSR引物对黄花苜蓿、多变苜蓿及紫花苜蓿共10个居群的遗传多样性及亲缘关系进行了研究，结果显示，10个居群间的遗传距离介于0.05～0.23，平均值为0.12。王赫等[36]用RAPD标记对黄花苜蓿、紫花苜蓿和杂花苜蓿品种进行了聚类分析，草原1号(杂化苜蓿)、草原3号(杂花苜蓿)、美国苜蓿王(紫花苜蓿)和达菲(黄花苜蓿)聚在同一类中。刘磊等[37]用ISSR标记对胡卢巴(Trigonellafoenum-graecum)、扁蓿豆和黄花苜蓿间的亲缘关系进行了研究，结果表明，供试材料间的相似系数介于0.86～0.92。刘磊等[38]用ISSR标记研究了紫花苜蓿、黄花苜蓿和胡卢巴属植物的亲缘关系，结果表明，紫花苜蓿、黄花苜蓿和胡卢巴种质资源间的相似系数介于0.85～0.94，其中胡卢巴属材料和紫花苜蓿材料间相似系数为0.85。这些结果都表明，紫花苜蓿、黄花苜蓿、杂花苜蓿、胡卢巴属植物之间亲缘关系较近。作为不同种、属的植物，彼此间较近的亲缘关系赋予了它们作为远缘杂交亲本独特的优势和开发潜力。近60年来，育种工作者在苜蓿远缘杂交方面进行了大量的研究和实践，已培育出许多优良品种，如甘农1号、草原1号、草原2号、图牧1号、新牧1号、龙牧801苜蓿、龙牧803苜蓿[39-40]。美国Sorensen等也用一年生蜗牛苜蓿(Medicagoscutellata)和多年生苜蓿为亲本进行杂交，育成了抗虫苜蓿新品种[34]。近年来，生物工程技术的迅速发展，又为远缘杂交技术注入了新的活力，与诸多植物资源一样，远缘杂交也将成为克服苜蓿种质资源遗传基础狭窄，引领苜蓿育种取得突破性进展的新途径。

29份苜蓿资源406对材料中，有47对材料间的相似系数小于0.767，表现出彼此之间相对较远的亲缘关系，其中有6对材料为栽培品种，表明除了野生种质资源具有遗传特异性外，仍有部分栽培品种间存在相对明显的遗传差异。聚类分析表明，栽培品种在相似系数为0.863处聚为3个亚类，其中兰杰兰德紫花苜蓿单独聚为一个亚类。在主成分分析图中，陇东野生紫花苜蓿、拜城野生紫花苜蓿、兰杰兰德、大西洋、渭南等紫花苜蓿材料的位置相对孤立，表现出与其他材料间相对较远的亲缘关系。目前，关于遗传距离能否预测杂种优势的研究还存在争议，但也有大量研究表明，亲本的亲缘关系与杂种优势存在一定的相关性[41-44]。在一定范围内，亲本遗传基础差异越大，其后代的分离范围就越广泛，从而获得优良杂种后代个体的机会也就越多[34]。因此，在苜蓿育种实践中应尽量选择这些与其他材料间亲缘关系较远且综合农艺性状较好的材料为亲本，由于其后代的遗传基础丰富，可能会获得分离范围较大的群体。如果不考虑材料的亲缘关系，只根据农艺性状选配亲本，苜蓿育成品种遗传基础将会日趋狭窄。

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(责任编辑 武艳培)

Genetic diversity analysis of wild and cultivated alfalfa germplasm resources by isozyme markers

CHEN Li-qiang1, SHI Shang-li2, MA Chun-hui3

(1.College of Animal Science, Tarim University, Key Laboratory of Tarim Animal Husbandry Science and Technology, Xinjiang Production & Construction Group, Alaer 843300, China;2.Pratacultural College of Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, China;3.College of Animal Science and Technology, Shihezi University, Shihezi 832000, China)

The genetic diversity of two wild alfalfa (Medicagosativa) accessions and 27 alfalfa cultivars were investigated using peroxidase, catalase and amylase isozyme polymorphism. A total of 30 stable bands were observed by three isozymes across 29 accessions, and six of which were specific bands which were only detected in Longdong wild alfalfa, Baicheng wild alfalfa, Langersteiner cultivar and Atlantic cultivar. The percentage of polymorphic bands (PPB) for peroxidase, catalase and amylase were 75.00%, 55.56% and 33.33%, respectively. The similarity coefficient among 29 accessions ranged from 0.633 to 1.000 and averaged at 0.867. Compared with the similarity coefficient values between wild alfalfa accessions and cultivars, the similarity coefficient values among cultivars were relatively higher. Cluster analysis indicated that 29 accessions can be divided into three defined groups at the similarity coefficient value of 0.772, and two wild alfalfa accessions were clustered in two independent groups, respectively. The position of Longdong wild alfalfa and Baicheng wild alfalfa in graph of principal component analysis was relatively isolated which suggest that wild alfalfa accessions had relatively distant genetic relationship with cultivars.

alfalfa; wild germplasm resources; cultivars; isozymes; genetic diversity

MA Chun-hui E-mail: chunhuima@126.com

10.11829j.issn.1001-0629.2013-0481

2013-08-18 接受日期：2013-11-29

国家牧草产业技术体系(CARS-35)；新疆生产建设兵团塔里木畜牧科技重点实验室开放课题(HS201103)；“十二五”国家科技支撑计划，新疆绿洲区优质牧草选育及生产利用技术集成与示范(2011BAD17B05-2)；农业部全国畜牧总站“牧草种质资源保种”项目

陈立强(1981-)，男，甘肃会宁人，讲师，硕士，研究方向为牧草种质资源及遗传育种。E-mail:clqdky@126.com

马春晖(1966-)，男，新疆哈密人，教授，研究方向为牧草生产与加工。E-mail:chunhuima@126.com

S816;S551+.703

A

1001-0629(2014)06-1070-10*1