进境木片松材线虫PCR检测方法研究

魏秋学，许美燕，缪爱斌，陈劲松，曾思海，吕国荣

(1.泉州出入境检验检疫局 362000;2.漳州市疾病预防控制中心;3.南京出入境检验检疫局)

随着我国保护森林资源政策的实施，国内对原木、板材等资源性原料的需求量急剧增加，木片作为一种林木资源类造纸原料得到企业的广泛关注。2009年10月，泉州口岸在全国首次以散装船载方式进口造纸木片，至今进口量已超90万t，并有逐步增加的趋势。常规口岸线虫检疫首先需要从可疑病木样中分离出线虫，然后进行线虫形态鉴定，一般耗时较长。笔者利用松材线虫rDNA内转录区(ITS)特异性引物，对口岸入境木片携带的线虫基因组DNA进行特异性PCR扩增，建立一套快速准确的线虫检测鉴定方法，并应用于口岸现场检疫鉴定，提高口岸进境木片携带线虫的鉴定速度和准确性。

1 材料与方法

1.1 供试材料

引物特异性检测采用的阳性松材线虫样本来源有2种，一种是从病木上分离并经鉴定为松材线虫的样本，另一种是南京农业大学实验室繁殖保存的松材线虫样本。拟松材线虫由南京农业大学实验室提供，伞滑刃线虫由本实验室分离并经鉴定。检测样品为2012年7月至2013年12月泉州口岸入境的18批散装木片。

1.2 引物对

供试引物对采用3对。其中1对 (BXF/BXR)为夏彦飞等［1］采用的引物，2对 (SCFa/SCRa、SCFb/SCRb)为运用BioEdit软件比较GenBank中已公布的松材线虫和其他松树上寄生线虫 (拟松材线虫、伞滑刃线虫等)的rDNA的保守序列差异，通过Primer premier 5.0软件设计 (表1)。

1.3 引物特异性检测

采用单条线虫 PCR反应体系［2］。……