NF-κB结合元件缺失对NOX1启动子转录活性的影响*

吴炜景， 李 理， 徐采云， 黄文杰△

(1福建医科大学附属第二医院呼吸内科，福建 泉州 362000； 2广州军区广州总医院呼吸内科，广东 广州 510010)

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(NADPHoxidase，NOX/DUOX)家族是产生ROS的重要来源，是急性肺损伤过程中诱导产生细胞氧化应激的主要参与者。本实验室的前期研究表明，采用代表性的炎症因子TNF-α刺激肺泡Ⅱ型上皮细胞来源的A549细胞，可观察到放大的炎症反应和过度的氧化应激，造成细胞凋亡水平上升，细胞存活率下降[1-2]。因此，明确NOX/DUOX家族基因的表达机制，是炎症反应时调控其衍生的ROS维持在适当水平、减轻内源性氧化损伤的基础。在以高氧诱导的急性肺损伤小鼠模型中，NOX1在肺泡上皮细胞氧化损伤中的作用可能大于NOX2[3]。我们前期的研究提示NF-κB可能参与了TNF-α诱导的肺泡上皮细胞氧化损伤[2, 4]，我们推测其与NOX1的转录调控密切相关。鉴此，本研究采用生物信息学分析技术，获取NOX1基因近端启动子区NF-κB结合元件序列，通过构建相应的含NOX1启动子区及NF-κB结合元件缺失的启动子区萤光素酶重组载体，探讨该NF-κB对NOX1基因转录的调控作用。

材 料 和 方 法

1 细胞培养

A549细胞由广州军区广州总医院医学实验科细胞库提供，在含10%灭活小牛血清、1×105U/L青霉素和100mg/L链霉素的RPMI-1640培养基中置于37 ℃、5% CO2、饱和湿度条件下的培养箱中培养，2～3 d传代1次，取处于对数生长期的细胞用于实验。

2 主要试剂

RPMI-1640高糖培养基、胰酶和小牛血清购自HyClone；重组人TNF-α购自PeproTech; Lipofectamine 2000和Opti优化培养基购自Invitrogen；PCR试剂购自康为世纪公司；PCR引物由英骏公司合成；……