周络通提取物Z-6对高糖所致Schwann细胞损伤和PI3K/Akt/nNOS通路的影响*

梁俊清， 徐海波， 陈 檬， 王志鑫， 徐明远， 姚 兵， 李文燕， 李辉欣， 侯 斌， 宋燕飞， 王 娜， 庞 洁

(1北京以岭药业有限公司，北京 102600； 2承德医学院附属医院，河北 承德 067000)

糖尿病周围神经病变(diabeticperipheralneuro-pathy,DPN)是糖尿病最常见和最复杂的并发症，是导致足溃疡、感染以致坏疽截肢的主要危险因素，已成为糖尿病患者丧失劳动能力的主要原因之一[1]。目前对DPN仍无特效的治疗方法，虽然中医药治疗DPN有较多报道，但其药效物质基础和作用机理研究不够深入，目前国内尚缺乏治疗该病疗效确切特别是具有创新理论指导的中成药。中药周络通(Zhouluotong,ZLT)胶囊的研制开辟了应用络病理论治疗DPN的有效新途径[2-3]。本研究利用体外细胞水平的筛选技术筛选复方中发挥药理作用的主要有效部位，并探讨PI3K/Akt/nNOS信号通路在其改善糖尿病周围神经病变中的作用。

材 料 和 方 法

1 细胞株

雪旺氏细胞(Schwann cells)，购于中国科学院细胞库。

2 主要试剂

DMEM培养基、胎牛血清(Gibco)；周络通及其提取物Z-5、Z-6(石家庄以岭药业股份有限公司)；甲钴胺对照品(中国食品药品检定所)；CCK-8检测试剂盒(日本同仁化工所)；神经元型一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase,nNOS)、Bcl-2、Bcl-xL、Bax、Bak和caspase-3及磷酸化Akt 抗体(CST)；磷酸化nNOS抗体(Abcam)；荧光Ⅱ抗(LiCor)；Ca2+-ATPase试剂盒及NO测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)；细胞凋亡检测试剂盒(凯基生物)；FuGENE® HD Transfection Reagent转染试剂盒(Promega)。

3 主要方法

3.1配制高糖培养基 称取一定量的D-葡萄糖溶解于无血清DMEM培养基中(含0.1% 胎牛血清)，终浓度为100 mmol/L。用0.22 μm微孔滤器过滤除菌。

3.2配制周络通及其提取物Z-5、Z-6贮存液 称取一定量的周络通溶解于无血清DMEM培养基中，超声促溶1 h， 6 500×g离心10 min, 收集上清液，用0.22 μm微孔滤器过滤除菌。……