着色性干皮病基因D和p53对HBV复制的影响*

丁 浩， 张吉翔

(南昌大学第二附属医院消化内科，江西 南昌 330006)

着色性干皮病基因D(xeroderma pigmentosum D，XPD)是转录因子ⅡH(transcription factor ⅡH，TFⅡH)的其中一个组份[1]。已有研究发现，XPD可保护宿主细胞，阻止HIV和MMLV的感染，并下调已整合病毒的表达[2]。所以我们提出假设：XPD亦能抑制乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)复制。本研究组已经证实，XPD能升高p53的表达[3-4]。因此，我们亦可提出假设：XPD可能通过p53通路抑制HBV复制。为证实上述假设，本研究把重组人XPD质粒用脂质体转染进入人肝癌细胞株HepG2.2.15(整合并能复制HBV的HepG2细胞)，并使用pifithrin-α(p53抑制剂)孵育细胞，然后测定乙型肝炎表面抗原(hepatitis B surface antigen，HBsAg)、乙型肝炎e抗原(hepatitis B e antigen，HBeAg)和乙型肝炎病毒X蛋白(hepatitis B virus X protein，HBx)的mRNA水平，检测培养上清液中HBsAg、HBeAg和HBV-DNA含量，同时测定细胞内核心颗粒中HBV-DNA含量，探讨XPD与p53对乙型肝炎病毒复制的影响。

材 料 和 方 法

1 材料

肝癌细胞株HepG2.2.15是由复旦大学附属华山医院传染科张轶俊博士惠赠；DMEM培养基购自HyClone；胎牛血清购自Gibco；G418购自Solarbio；重组质粒pEGFP-N2/XPD由本实验室构建，pEGFP-N2/XPD已经通过PCR反应、酶切及基因测序鉴定[5]；RNA提取试剂Trizol和脂质体LipofectamineTM2000购自Invitrogen；p53抑制剂pifithrin-α购自Sigma；逆转录试剂盒购自Fermentas；引物购自Generay Biotech；2×Taq PCR Master Mix购自天根生物；HBsAg和HBeAg的ELISA检测试剂盒购自广东中山生物工程有限公司； VERSANT HBV branched DNA (bDNA) 检测试剂盒购自Bayer；HBV-DNA荧光定量PCR试剂盒购自广州中山大学达安基因公司。

2 方法

2.1细胞培养、质粒转染和pifithrin-α的孵育 把HepG2.2.15细胞放置于含有10%胎牛血清、400 mg/L G418和双抗(100 mg/L链霉素和1×105U/L青霉素)的DMEM培养瓶中，在37 ℃、5% CO2和饱和湿度的培养箱中培养。以每孔1×105细胞的密度把细胞铺于6孔板中，24 h后细胞融合率为90%。使用LipofectamineTM2000将空载质粒pEGFP-N2和重组质粒pEGFP-N2/XPD转染进入细胞，质粒4.0 μg/well，脂质体10 μL/well介导转染。……