MicroRNA-16对类风湿关节炎患者滑膜成纤维细胞增殖、侵袭及细胞因子分泌的影响

史栋梁， 史桂荣

(1河南省中医院风湿骨病科，河南 郑州 450002； 2商丘医学高等专科学校，河南 商丘 476100)

类风湿关节炎(rheumatoidarthritis，RA)是一种全身性的自身免疫疾病，以慢性、对称性多关节炎为主要临床表现。它的发病机制复杂，已有多种细胞、细胞因子和蛋白酶类参与[1]。滑膜成纤维细胞(synovialfibroblasts，SFs)的活化及致炎因子的分泌是导致RA炎症和组织破坏的直接机制[2]。MicroRNAs(miRNAs)是一类新型保守的非编码单链小分子RNA，广泛存在于各种生物体中。多项研究表明，miRNA与RA的发生、发展密切相关[3-4]。miR-16是miRNAs家族的重要成员，近期研究证实，RA患者中miR-16的表达水平明显增高，提示miR-16可能在RA的病理进程中发挥重要作用[5]。因此，本研究以RASFs为对象，构建miR-16过表达和低表达的RASFs模型，分析miR-16对RASFs增殖、侵袭及胞外基质、炎症因子水平的影响，为RA的防治提供新的靶点。

材 料 和 方 法

1 材料、试剂和仪器

人关节滑膜组织取自河南省中医学院二附院关节外科行关节置换术的RA患者，患者均签署知情同意书，RA患者临床诊断均符合美国风湿病学会标准。

RNAiso Plus kit、PrimeScript® RT reagent kit、SYBR®PremixExTaqTMII kit、LipofectamineTMRNAiMAX、抗β-肌动蛋白抗体、抗基质金属蛋白酶3/13(matrix metalloproteinase 3/13，MMP3/13)抗体、抗IL-1β抗体和辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG(Invitrogen)；iQ5实时定量PCR仪和激光共聚焦显微镜(Bio-Rad)；miR-16 mimic和miR-16 抑制剂(Thermo Scientific)；ECL化学发光试剂盒、MTT、DMSO、DMEM培养基、annexin V-FITC和PI(Sigma)；CO2细胞培养箱(Binder)；流式细胞仪(Olympus)。

2 方法

2.1RASFs的培养 术中取出滑膜组织，立即于无菌条件下剪碎，2.5 g/L胰蛋白酶37 ℃消化2 h后，离心收集细胞，置于37 ℃、5% CO2培养箱内培养。当细胞长至接近融合状态后即可传代，第3～8代用于实验。

2.2细胞的分组及转染 实验分为4组：空白对照组(control)、脂质体对照组(mock)、miR-16抑制剂组及miR-16mimic组。……