纤维素酶的研究现状与前景

张 隽

（哈尔滨师范大学，黑龙江 哈尔滨 150025）

0 前言

纤维素是自然界中分布最为广泛的生物资源，我国每年产生的纤维素资源总量超过15亿吨。但是，由于降解工艺的不成熟，成本过高等问题的存在，限制了纤维素的应用。随着科学技术的发展，可再生能源的应用成为了研究的热点。纤维素最为自然界中数量最为庞大的可再生资源将会成为能源，化工领域的重要原材料。同时，纤维素资源的有效利用对于解决世界能源危机，粮食短缺问题和环境污染问题有着重要意义。

纤维素广泛分布于植物体之中，纤维素是植物细胞壁构成的主要成分，占植物干重约三分之一到三分之二。但是大量的纤维素只有一小部分被用于人类的日常生产生活中，绝大多数都通过微生物分解等途径回归到自然界的碳循环中。

纤维素是一种多糖，是以纤维二糖为基本单位，由许多β-D-葡萄糖分子以β-（1，4）糖苷键连接而成的高分子聚合物。纤维素分子羟基上的氢与相邻羟基上的氧之间可以形成氢键。纤维素分子之间存在的氢键力使其在常温下比较稳定。纤维素的大分子间形成氢键的多少、强弱不同，形成了结晶区和无定形区。每个氢键的引力虽然很小（20.9～33.5kJ/mol），但由于氢键很多，所以总的引力很大（共价键336～378kJ/mol氢键 21.0～33.6 kJ/mol范德华力 8.4～12.6kJ/mol）。 因而天然纤维素倾向于缠绕在一起，形成了结晶状不溶性的刚性结构。以致密的晶体结构严重阻碍了化学试剂或者生物酶与纤维素表面的有效接触和作用，因此造成了天然纤维素非常的难水解。但是纤维素非常容易被纤维素酶水解，所以纤维素酶降解纤维素的研究成为纤维素应用领域研究的重点。

纤维素酶不是单一的酶，是一类能够将纤维素降解为葡萄糖的多组分酶系的总称，它们协同作用，分解纤维素产生寡糖和纤维二糖，最终水解为葡萄糖。

1 纤维素酶系的组成

纤维素酶是一种多成葡萄糖[1]，它包括内切葡聚糖酶（CMC）、外切葡聚糖酶（CBH）、β-葡萄糖苷酶(BG)。内切酶分子量在23kD-146kD，外切酶在38kD-118kD，纤维二糖酶大部分大于70kD，有的少于400kD。在它们相互协同作用下纤维素可以降解纤维素生成葡萄糖。下面对三种酶进行简单介绍：

1.1 内切葡聚糖苷酶（CMC酶）

酶解主要产物是纤维糊精、纤维二糖和纤维三糖。CMC酶随机地水解β-1，4-糖苷键，将长链的纤维素分子截短变成许多纤维素末端。它主要作用于纤维素的非结晶区和一些可溶性的底物如羧甲基纤维素和羟乙基纤维素。同时，它也可以将小分子的纤维素寡糖水解。值得注意的是，它不能降解结晶区的纤维素。

1.2 外切葡聚糖苷酶（CBH酶）

CBH酶在天然纤维素的降解过程中起到很重要的作用。它水解β-1，4糖苷键，每次作用只切下一个纤维二糖分子。和CMC酶不同的是CBH酶可以作用于纤维素分子的结晶区、无定形区以及羧甲基纤维素。有实验发现了另一种酶，它们先从还原性末端将纤维二糖切下，可以看出自然界中存在两类CBH酶，分别从还原端和非还原端水解纤维素分子。

1.3 纤维二糖酶（BG酶）

它水解纤维二糖和较短链的纤维寡糖生成葡萄糖，是一种非专一性酶，可以水解多种β-糖苷键。纤维二糖抑制纤维素酶的反馈作用，而BG酶可以减轻这种抑制从而加快反应速度，所以有人提出纤维二糖酶不属于纤维素酶的说法。

目前认为，纤维素完全降解成葡萄糖至少需要以上三种功能不同但又互补的纤维素酶组分协同作用才能完成[2]。

2 纤维素酶的活性特点及分子结构

Tilbeugh等对纤维素酶拆分研究发现，降解纤维素的酶是由约56KD球状的纤维素催化结构域（catalytic domains，CD或 core protein，CP）、氨基酸序列较为保守但没有催化作用纤维素结合结构域(Cellulose-Binding Dom sins，CBD)和高度糖基化的连接肽-连接桥（Linker）三部分组成[3]。

2.1 催化结构域

它是由α/β组成的筒状结构：由5个α螺旋和7条β链组成，活性部位是由两个延伸至表面的环（loop）所形成一个隧道状（tun-nel）结构，长度大约2nm，包含4个结合位点，水解糖苷键的反应发生在第2和第3结合位点之间。研究表明，这种隧道结构，可以连续催化完成几个糖苷键的断裂反应。纤维素酶属于糖基水解的大家族，跟其他糖基水解酶的不同之处在于它的催化结构域能够水解葡萄糖残基之间的 β-1，4 糖苷键。

2.2 纤维素结合结构域

相对于催化结构域来说，不同微生物来源的纤维素酶在这一部分差别较大，不同微生物来源的纤维素酶，其CBD在酶分子一级结构的氨基酸肽链上的位置会有不同，多数 CBD位于酶序列的C-末端或N-末端，少数位于中间。CBD部分氨基酸同源性在不同微生物类群间差异较大，同一种微生物不同纤维素酶CBD的氨基酸序列具有同源性，不同种类微生物纤维素酶CBD的氨基酸序列同源性较小。真菌CBD的序列之间有更多的相似性，真菌和细菌之间还没有发现明显的序列同源性。对真菌和细菌纤维素酶的CBD三维结构的解析表明，真菌CBD由33-36个氨基酸组成，且具有高度的同源性；而细菌由100-110个氨基酸组成，同源性较低。真菌的外切酶的CBD的结构呈楔型，一面亲水，另一面疏水，且亲水面结中只有3个Tyr芳香族氨基酸执行吸附纤维素的功能。细菌外切酶的CBD很大，包含很多芳香族氨基酸，其中的 Trp54和 Trp72暴露于酶蛋白分子表面，执行吸附功能。

CBD主要维持酶分子构象的稳定性使纤维素酶结合于纤维素表面，使得临近的催化域易于接近底物促进底物的水解.CBD的存在对于外切葡聚糖酶的识别底物及催化尤为重要。缺少CBD的酶能聚集成多酶复合物并由其中某特定非催化组分介导而结合纤维素。

2.3 连接桥

纤维素酶复合物的催化结构域CD与纤维素结合结构域CBD之间通过一段相当长、高度糖基化的连接肽连接，在一级结构和三维结构的研究中发现该区域富含脯氨酸和羟脯氨酸。细菌纤维素酶linker富含Pro和Thr，完全由Pro-Thr这样的重复顺序组成，而真菌的纤维素酶linker富含Pro、Ser和Thr，并且数量上比细菌的少，仅有30-40个氨基酸残基，而细菌的则约由100个氨基酸残基组成。由于纤维素酶复合物的连接肽常暴露于水相，对蛋白酶又非常敏感，所以，这段肽链也常常被O-gly-cosilated糖基化防止被蛋白酶水解。不同纤维素酶linker的糖链及其糖基化程度不同，并且糖基化也不是纤维素酶活力所必需的。连接肽的作用可能是保持CD和CBD之间的距离，有助于不同酶分子间形成较稳定的聚集体。

3 纤维素酶的作用机制

纤维素底物结构的复杂性决定了纤维素作用机的多样性，同时作用的底物均为不溶性的纤维素，所以它的作用机理比可溶性物质为底物的酶复杂了很多，阐明纤维素酶的作用机理同样也就变得困难了一些。纤维素酶的作用机理主要与纤维素酶的组成部分、活性特点、分子结构、及其作用底物的性质等多方面因素相关。将天然纤维素水解为葡萄糖是先从内切葡聚糖酶开始的：内切葡聚糖酶首先会在纤维素分子链上一些相对比较比较薄弱的位置上作用，打开分子链，将结晶纤维素水解成无定形纤维素和可溶性低聚糖，然后外切葡聚糖酶断开纤维素分子链中的氢键，这时会产生很多纤维素片段，纤维素分子被分解为纤维素二糖和纤维三糖等，其作用很可能是从微晶纤维素中使纤维素链脱离解聚，释放游离端。最终内切葡聚糖酶和纤维二糖酶将这些纤维素片段断开变成单个的葡萄糖分子。BG酶一般不直接作用于纤维素，而是通过降解内切酶和外切酶的水解产物，最终产生葡萄糖，而消除纤维二糖对纤维素降解的抑制作用，因此它成为将纤维素快速降解的一类酶。由此可知，内切葡聚糖酶 （CMC）、外切葡聚糖酶（CBH）、葡萄糖苷酶（BG）在作用机制上是不具有绝对专一性的，在功能效果上也不同，但是值得肯定的是在纤维素降解成葡萄糖的过程中使通过他们之间的协同作用完成的，若将各种纤维素酶组分按照一定质量比例混合，可发生最大的协同水解作用。

4 纤维素的应用

4.1 在食品工业方面的应用

如果在大豆制酱的加工过程中利用用纤维素酶进行脱皮，在提高产品质量的同时又大大降低了成本，也可以用于从大豆和叶子中提取蛋白质和淀粉类物质；用纤维素酶还可以提高面制品的烘焙和营养的品质，延长保质期。果蔬中含有大量纤维素，如果使用传统的方法进行加工会破坏口感、流失营养，但如果采用纤维素酶处理会使植物组织软化利于被人体吸收，因此采用食品级采用酶制剂对水果进行有效的降解，增加了果汁的产率，改善产品颜色和提高了其稳定性。

4.2 在酿造、发酵工业方面的应用

纤维素酶应用在啤酒发酵中，在少量的大麦发芽中加入纤维素酶，能够有效降解 β-1，3-糖苷键和 β-1，4-糖苷键，因此帮助了大麦发芽，此外纤维素酶还可以降解酒糟，增加啤酒的过滤效率。纤维素是植物细胞壁的主要成分，因此纤维素酶直接作用于植物细胞壁，可以在食醋发酵过程中提高反应速度，主产物的出产量也会提高。

4.3 在饲料工业方面的应用

纤维素酶可用于多种纤维素质原料的糖化处理，纤维素酶添加量通常在0.1%-0.3%就能够分解结构复杂的纤维素，课用于生产蛋白饲料，增加了饲料的来源。纤维素酶可以把饲料中不易被消化的纤维素降解为糖和菌体蛋白，提高了饲料的利用率及其利用价值，同时能够增加动物的食欲，加速动物的生长发育。因此研究开发纤维素酶饲是应用纤维素酶的一个重要领域。

4.4 在其他工业方面

用纤维素酶适当处理纸浆，能增加微细纤维生成量和提高保水度，有可能提高纸张的抗张力；利用纤维素酶对纤维织物进行生物整理，经纤维素酶整理的织物具有滑爽、布面清晰、悬垂性好、吸湿性强等特点，并具有一定的丝光效果；纤维素酶在草药提取方面也有一定应用。

5 展望

纤维素酶将纤维素转化为糖仅仅是个开始，还要将葡萄糖转化为其他附加值较高的产物，如乙醇和有机酸物质，在这个过程中的一个关键步骤是纤维基质的预处理，可以降低生产成本、增加原料利用率。纤维素酶种类繁多，来源很广，不同来源的纤维素酶的结构和功能存在很大的差异，虽然还需要漫长的研究过程但是值得肯定的是其作用范围相当广泛。

［1］曹健.里氏木霉纤维素酶的纯化和性质[J].食品科学,2003(5)：72-74.

［2］林风.纤维素酶的生物化学和分子生物学的研究进展[J].生命科学,1994,6(1)：18-23.

［3］Hanlin R.Microcycle conidiation-a review[J].Myco science,1994,35(1)：113-123.