异氟醚对乙酰胆碱诱导的细胞外信号调节激酶磷酸化的抑制效应

邢 准，张岩生，刘 坤，邱 鹏

0 引言

异氟醚是一种广泛用于临床的吸入全身麻醉药物，可以对血压、脑血流、脑代谢等有影响，甚至直接作用于神经的电传导和物质代谢。流行病学研究发现,异氟醚能够导致术后认知功能障碍的发生率增高，并证实是其发病的独立危险因素之一[1-2]。吸入麻醉药可能通过抑制神经元乙酰胆碱(Acetylcholine，ACh)受体发挥作用，乙酰胆碱受体包括毒蕈硷型(mAChR) 和烟碱型(nAChR)，广泛存在于神经系统中，与大脑的认知功能密切相关。G蛋白偶联的乙酰胆碱受体可以激活一系列蛋白激酶，包括细胞外信号调节激酶1/2(Extracellular signal-regulated kinase 1/2，ERK1/2)，ERK可调节突触和神经元的可塑性及学习和长时程记忆形成[3]。蛋白激酶B(Protein kinase B，PKB)通路也是调控应激反应和细胞生存、凋亡的重要通路。有研究表明,吸入全身麻醉药物可以增加蛋白激酶B磷酸化从而发挥麻醉药预处理作用[4-5]。本研究以体外培养的神经元样PC12细胞为基础，研究异氟醚处理对乙酰胆碱诱导的细胞内信号传导的影响，探讨挥发性麻醉药影响认知功能的分子机理。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器 DMEM高糖培养基(美国Gibco 公司)，新生牛血清(杭州四季青生物工程公司)，碘化乙酰胆碱(美国Sigma公司)，异氟醚(英国雅培公司)，抗体均购自美国Santa Cruz公司。HERA CELL 150型CO2培养箱(德国Heraeus 公司)，TE2000-U 系列倒置显微镜(配有CCD 软件，日本Nikon公司)，ULTIMA气体浓度监测仪(美国Ohmeda公司)，ABI7500定量PCR仪(美国ABI公司)，Gbox-chemiHR-E电泳成像分析系统(美国Gene公司)。

1.2 培养细胞及分组 高分化的大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤(PC12)细胞株购自北京金紫晶生物医药技术有限公司。将复苏后的PC12 细胞接种于涂有多聚赖氨酸的75 mL 培养瓶中，培养液为含有10%新生牛血清和1%双抗(青霉素和链霉素) 的DMEM 高糖培养基,在37 ℃、5 %CO2饱和湿度培养箱中生长。每3天传代一次。取对数生长期的PC12 细胞，以4×105/mL 的密度接种于24孔板，培养箱培养18 h后更换无血清DMEM培养基，参考文献[6]将培养板置于浓度1.2%的异氟醚密闭箱内进行处理2 h，采用ULTIMA气体浓度监测仪监测异氟醚浓度。分别于处理后0 min、1 h、3 h加入碘化乙酰胆碱(终浓度10 μM)刺激2 min后收集细胞，-80 ℃冻存。

1.3 蛋白印迹实验 采用RIPA buffer按照说明书分离提取细胞总蛋白，取少量BCA法测定蛋白浓度，上样量按每孔20 μg总蛋白，SDS-PAGE电泳(浓缩胶浓度5%，分离胶浓度8%)分离蛋白，半干法转印至PVDF膜上(10 V,1.5 h)。转印膜用5%牛血清白蛋白(BSA)室温封闭1 h，与TTBS缓冲液(含1%BSA)稀释的抗p-ERK1/2(sc-7383，1∶500)和p-PKB(sc-101775，1∶1 000))一抗溶液4 ℃杂交过夜。洗膜后与1∶2 000稀释的辣根过氧化物酶标记的二抗室温下孵育2 h，ECL 化学发光系统检测反应产物信号，采用Gbox-chemiHR-E电泳成像分析系统拍照并计算蛋白条带的光密度值。同样步骤进行内参GAPDH(sc-48166)测定，每个样本重复3次取平均值，目标蛋白的相对表达量以其与内参GAPDH的光密度相对比值表示。

2 结果

2.1 异氟醚对乙酰胆碱诱导的ERK1/2的磷酸化水平的影响 与对照组比较，单纯异氟醚处理对PC12细胞中ERK1/2磷酸化水平没有明显影响，而单纯ACh刺激可导致ERK1/2磷酸化水平显著增加(P<0.01)，但异氟醚处理可明显阻碍ACh 升高ERK1/2磷酸化的效应(P<0.01)。这种干扰作用持续存在，异氟醚处理1 h后，PC12细胞中ERK1/2磷酸化水平仍然明显低于单纯ACh刺激组(P<0.01)。至异氟醚处理3 h后，两组细胞中ERK1/2磷酸化水平没有明显差异。

2.2 异氟醚对乙酰胆碱诱导的蛋白酶B的活性的影响 单纯ACh刺激对PKB磷酸化水平没有明显影响。与之相反，异氟醚处理可明显增加PC12细胞中基础状态下PKB的磷酸化水平(P<0.05)，异氟醚和乙酰胆碱共同处理导致PKB磷酸化水平达峰值(P<0.05)。异氟醚处理1 h后，PC12细胞中PKB的磷酸化水平略高于对照组，但差异无统计学意义(P=0.082)。异氟醚处理3 h，后PKB磷酸化完全恢复正常水平。

3 讨论

术后认知功能障碍是术后常见的并发症，主要表现为幻视、幻听、情绪状态的改变和学习记忆功能的下降。术后认知功能障碍发病率较高，其影响因素众多，确切发病机制目前尚不清楚，可能与年龄、手术应激及麻醉药等相关。异氟醚是全身麻醉的主要用药之一，在临床工作中广泛使用。流行病学调查发现，异氟醚能够导致术后认知功能障碍的发生率增加，是后者的独立危险因素之一[7-8]。基于动物模型研究也证实，异氟醚等吸入麻醉药物能够影响实验动物的学习记忆功能，降低大鼠的认知能力，机理可能与麻醉药改变了中枢神经系统的蛋白表达相关[9-10]。

图2 PC12细胞中ACh刺激对PKB活性的影响以及异氟醚处理的协同效应

乙酰胆碱是中枢神经系统内重要的神经递质，参与意识活动、学习记忆等多种复杂功能[11]。Fernandes 等[12]发现，ACh受体缺陷的小鼠存在学习、记忆等认知能力低下的现象。胆碱能系统阻滞同样引起人类记忆、学习功能减退，临床表现为进行性认知障碍和记忆力损害为主的阿尔茨海默病与胆碱能系统活性下降密切相关[13]。乙酰胆碱受体广泛存在于神经系统中，与大脑的认知功能密切相关。G蛋白偶联的mAChRs 可以激活一系列信号通路，包括RAS-ERK通路，除了调控细胞增殖和分化，该通路的激酶ERK1/2在成熟的神经元中也大量富集，参与调节突触和神经元的结构和功能可塑性及学习和长时程记忆形成。RAS-ERK信号通路损坏的小鼠在水迷宫训练中丧失记忆水下平台的能力[14]。

研究表明，乙酰胆碱在中枢的传递可能是吸入性麻醉药的作用靶点之一，多种吸入性麻醉药可以强烈而可逆地抑制神经元中的乙酰胆碱受体，可能由此产生失忆效应[15]。本研究以高分化的褐家鼠肾上腺嗜铬细胞瘤PC12细胞为基础，研究异氟醚是否干扰神经细胞内神经递质乙酰胆碱对信号通路关键激酶的诱导效应。结果显示，单纯乙酰胆碱刺激可快速增加神经样细胞中ERK1/2的磷酸化水平，单纯异氟醚处理对ERK信号通路没有影响，但是异氟醚可以作用于乙酰胆碱受体，从而阻断乙酰胆碱对ERK信号通路的刺激作用。这种阻断效应在终止异氟醚处理后，仍可持续1 h以上，分析可能是细胞结构中少量残留的脂溶性异氟醚即足以阻断乙酰胆碱的作用。异氟醚虽然自身对ERK1/2的活性没有影响，但可明显增加PKB的磷酸化水平，与以往的报道相一致[16]。但与对ERK的间接影响效应相比较，这种刺激效应很短暂，说明神经元样细胞内不同的信号通路对异氟醚处理的效应浓度和效应时程也不相同，提示在麻醉术后体内残留的异氟醚可能主要通过干扰乙酰胆碱相关的ERK信号通路，从而影响认知功能。

总之，本实验在体外研究初步证实异氟醚可以长时程减弱乙酰胆碱诱导的蛋白激酶活化，从而干扰胞内信号传递，这可能与术后认知功能障碍发生密切相关。未来有必要采用动物模型进一步研究异氟醚对胆碱能神经元的胞内信号通路的影响，探讨麻醉后认知功能障碍发生的分子机制。

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