集成联合用药、隔离早期断奶SEW和“三点式”生产体系培育猪气喘病阴性群

甘源　华利忠　熊祺琰等

摘要：为探索猪肺炎支原体阴性群的培育方法，本试验研究了集成联合用药、SEW和“三点式”饲养管理体系等技术对猪肺炎支原体的净化效果。先通过妊娠母猪的筛选，母猪程序性用药，SEW技术，屏障隔离系统，“三点式”生产饲养管理体系及仔猪程序性用药的培育方法，再通过猪肺炎支原体血清抗体检测和荧光定量PCR检测鼻拭子的方法对所培育的仔猪进行长达4个月的监测，结果发现新培育的5批猪在35日龄后血清抗体均为阴性，鼻拭子抗原检测全为阴性。结果表明集成联合用药、SEW和“三点式”生产管理体系技术可以有效净化猪肺炎支原体，为国内猪气喘病的控制和净化提供理论基础及临床实践经验。

关键词：SEW；早期断奶；屏障系统；“三点式”生产饲养管理体系；药物净化；生物安全

中图分类号： S852.3；S858.286.3 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2014）07-0197-04

收稿日期：2013-12-20

基金项目：江苏省农业科技自主创新资金[编号：CX（13）3076]。

作者简介：甘源（1984—），男，湖北荆州人，硕士，从事动物重大疫病研究。E-mail：ganyuan19868@163.com。

通信作者：邵国青，研究员。E-mail：gqshaojaas@gmail.com。猪支原体肺炎（mycoplasmal pneumonia of swine，MPS）又称猪地方流行性肺炎、猪气喘病，是由猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp）感染引起的一种慢性呼吸道传染病，也是世界上最主要的猪病之一[1]，以咳嗽、喘气和生长发育迟缓为主要临床特征[2]。Mhp可通过直接接触或气溶胶传播[3-4]，其传播距离可达4.7 km[5]，极难防控。美国猪场45%的防疫费用于购买猪支原体肺炎灭活疫苗，但仍不能完全控制。近几年来，我国养猪业向集约化、规模化发展速度迅猛，由于国内大多数猪场管理不到位，生物安全重视程度不够，区域内猪场密度大，猪场内养殖密度大、生猪运输频繁等因素，加大了猪肺炎支原体的传播和感染，不仅降低各种参数，如降低饲料报酬延长了感染猪至出栏体重的生长时间，而且导致抗生素滥用，加大了养猪成本和给食品安全带来危害，给养猪业带来巨大的损失。如何经济有效地控制猪气喘病一直是困扰全球养猪业的难题，研究表明控制该病的最好方法是从源头抓起彻底净化病原。

早在1970年Juhr等就报道了无支原体肺炎的实验动物的控制方法[6]，20世纪70年代末至80年代初，英国Alerander等也创造了一种消灭猪病的新方法-MEW技术（治疗性早期断奶技术），紧接着20世纪90年代初期美国养猪界Dritz等又试行了一种隔离式早期断奶技术（segregated early weaning，SEW）。目前，美国60%的猪群都推行SEW，在日本和我国的台湾省、广东省也都进行了尝试。纪孙辉等的研究表明，用早期隔离断奶技术能使支原体阳性率下降68%[7]，说明使用SEW技术对防控猪气喘病有一定的效果，但并不能彻底净化病原，需要其他技术的辅助。后来国内外研究又探索了一些支原体的净化方法，其中瑞士减群法、程序性用药、早期药物隔离断奶技术和封群等技术比较流行[8]。西欧很多猪场在实施瑞士减群法净化Mhp时就用以延胡索酸泰妙菌素为主的用药方案。Alfonso等利用药物早期隔离断奶技术联合多点式生产模式成功净化了一个1 700头母猪猪场的肺炎支原体[9]，而这些方法最关键的是制定科学合理的净化措施。

针对目前猪肺炎支原体防控日益严峻的形势，本研究在结合对猪肺炎支原体防控及致病机理研究成果的基础上，借鉴前人的研究经验，联合运用MEW及“三点式”生产体系培育猪气喘病阴性群，通过为健康种猪核心群提供猪气喘病阴性种猪，从源头上控制和净化猪气喘病，为国内猪气喘病的防控和净化提供理论基础和实践经验。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1主要设备屏障系统：正压无菌动物房及隔离饲养器（江苏省农业科学院实验动物中心）；7500实时荧光定量PCR仪（美国Life Technologies公司）；无菌奶槽；排泄物处理装置；乳猪无菌运输箱等。

1.1.2主要试剂猪瘟ELISA抗体检测试剂盒、猪蓝耳病ELISA抗体检测试剂盒、猪伪狂犬gE ELISA抗体检测试剂盒和猪肺炎支原体血清抗体检测试剂盒购自美国爱德士生物科技公司；猪圆环病毒2型ELISA抗体检测试剂盒购自武汉科前动物生物制品有限责任公司；口蹄疫ELISA抗体检测试剂盒购自韩国金诺；Premix Ex TaqTM为宝生物工程（大连）有限公司产品。

1.1.3试验动物每批次选择常州某猪场3胎以上妊娠中期，支原体抗原抗体为阳性的无临床症状母猪和所产仔猪若干头。 共选取5批次。

1.1.4菌株及质粒载体Mhp菌株由江苏省农业科学院兽医研究所家畜重大疫病组保存。重组质粒pMD18-T/P97由江苏省农科院兽医研究所家畜重大疫病组制备。

1.1.5主要饲料和药品市售配方奶粉、教槽料购自江苏安佑科技饲料有限公司；80%泰妙菌素和盐酸多西环素购自上海诺华动物保健有限公司；复合电解多维、甲醛、聚维酮碘、2%过氧乙酸、生石灰、葡萄糖水为常规药品或试剂。

1.2方法

1.2.1“三点式”饲养模式饲养地点的选择及生物安全管理采用“三点式”生产体系[10-12]饲养技术和部分SPF管理技术[13]：其中A地点是支原体阳性场，B地点为正压无菌动物房及隔离饲养器，C地点为无疫病且具有优良的地理性隔离饲养点，根据最新研究发现猪肺炎支原体病原的传播距离可远至4.7 km[5]，固A、B、C这3个地点相距直线距离不少于 5 km 且饲养点周围5 km之内没有其他猪场和屠宰场，每个饲养点远离交通要道和人物流动性大的区域以避免引进新的病原，以针对饲养管理建立一个综合的生物安全体系（图1）。endprint

1.2.2阳性A场母猪群的筛选及产前预处理采集假定支原体肺炎阳性场的妊娠母猪群的血样和鼻拭子样本，通过荧光定量PCR及ELISA方法筛选抗原抗体阳性母猪群，确定试验动物来源，确定的支原体阳性场设定为A场；在A地点选择妊娠后期母猪，猪肺炎支原体阳性种猪群于产前20 d给药，80%泰妙菌素125 g/t+盐酸多西环素150 g/t +阿莫西林200 g/t，连续用药2周，产前1周停药。接产室每天用聚维酮碘500倍液喷雾消毒3次。预产前母猪全身消毒后送入消毒好的产房待产，并认真做好初乳仔猪的日常护理工作。在A场每批次随机挑选不做以上处理的母猪分娩的仔猪共10头设为对照组，标记、样品采集、抗原抗体检测（监测）同步进行。

1.2.3运用SEW获得仔猪在B地点隔离屏障系统内的饲养管理从阳性A地点挑选出健康状况良好的7日龄仔猪，采用无菌转运箱转移至远离母猪源的B地点隔离饲养，B地点的饲养环境为安装空气过滤屏障系统房间，并严格控制温湿度，严格执行隔离器饲养仔猪的日常管理制度。在转群和饲养的过程中严格消毒并注意生物安全，遵照饲养管理程序做好日常保健及除猪肺炎支原体外的其他疫苗免疫工作，补铁补锌、打耳号等。在饲养期间给予猪肺炎支原体敏感抗生素药物净化，即：1 L安佑产“奶妈奶”或1 kg教槽料中拌药：80%泰妙菌素1 g+电解多维4 g，连用直至35日龄转群至C地点。

1.2.4C地点隔离饲养方式遵照抗原抗体检测（监测）结果，从B地点挑选出健康状况良好的35日龄的仔猪，采用无菌转运箱转移至C地点隔离饲养，C地点安排有饲养经验的专人驻点饲养，在转群和饲养的过程中严格消毒并注意生物安全，遵照饲养管理程序做好日常保健及除猪肺炎支原体外的其他疫苗免疫工作。

1.2.5具体药物净化程序的制定及实施方法A地点：所有种猪（种公猪和种母猪）：1 t饲料中拌药：80%泰妙菌素 125 g+15%金霉素2 000 g +电解多维400 g，产前20 d给药，连续用药2周，产前1周停药。B地点：7日龄早期断奶直至35日龄转群，1 L“代母乳”或1 kg教槽料中拌药：80%泰妙菌素 1 g+电解多维4 g，连用直至35日龄转群至C地点。C地点：所有猪群，1 t饲料中拌药：80%泰妙菌素125 g+电解多维400 g，转群后连用7 d后停药，每月月初用药7 d，扩繁用种猪产前和配种前1周停药。

1.2.6猪肺炎支原体血清抗体检测A场对照组和B场、C场试验组于21、35、75、120日龄采集血样，运用血清学方法，即：运用美国IDEXX ELISA检测试剂盒监测血清中猪肺炎支原体特异性抗体。淘汰抗体阳性猪群。以后每隔1个月用同样方法采集样品进行监测。如有抗体阳性群，则整窝淘汰。另外，严格按操作说明检测猪瘟、蓝耳病、伪狂犬等疫苗抗体，如果有不符合要求的猪只及时补打疫苗或者淘汰处理。

1.2.7猪肺炎支原体鼻拭子样品抗原检测按照“1.2.6”的时间同步采集鼻拭子样品，运用分子生物学方法，即：按冯志新等的方法[14]处理鼻拭子样品，用已建立的荧光定量PCR[15]检测猪肺炎支原体病原监测鼻拭子中的猪肺炎支原体病原。淘汰病原阳性群。以后每隔1个月用同样方法采集样品检测（监测）1次。如有阳性群，则整窝淘汰。

1.2.8日常管理建立完善的日常记录台账及定期对试验猪群的血清学及分子生物学检测（监测）结果进行整理，建立净化档案，每一次转群都做到全进全出。每周定期对饲养环境进行彻底清洗消毒，使用3种消毒液交替使用，定期灭鼠灭蚊，全群驱虫。

1.2.9猪肺炎支原体净化方法本次研究猪肺炎支原体净化方法如图1所示。

2结果与分析

2.1培育猪群和对照猪群样品抗原检测结果

定期对上述5批培育猪和对照猪群所采集的血清和鼻拭子样品进行检测（监测），由表1可知试验猪群的抗原检测（监测）结果全为阴性，对照猪群抗原检测结果全为阳性，表明该净化方法可以有效切断支原体病原的水平和垂直传播。

2.2培育猪群和对照猪群的样品抗体检测（监测）结果

3.3运用程序性用药、SEW和“三点式”生产体系技术培育猪气喘病阴性群的关键点

本方法对仔猪7日龄进行早期隔离断奶后就将其转入正压无菌动物房内的物理性隔离器内饲养，使用的隔离器特征在于三级空气净化屏障系统为高效正压系统，通过三级高效的0.2 μm的通风过滤膜将携带猪肺炎支原体的气溶胶屏障在外，屏障系统特点为：能够很好地控制温湿度，投喂饲料、粪便收集、消毒及清理方便，对猪肺炎支原体净化具有很好的效果，大大降低了猪群通过呼吸携带致病因子的气溶胶而感染猪肺炎支原体的概率；但在实际生产中很难有这样的洁净条件，我们将在下一步的试验中遵循实际推广的要求逐一简化。

生产出猪气喘病阴性群后，对它的维持至关重要。国内外净化支原体的技术难点及净化失败的原因并不在生产猪气喘病阴性群上，主要是在阴性群维持上[16]，它是一个复杂、长期和艰巨的任务。维持的技术手段主要有科学的饲养管理体系、药物控制及疫苗免疫这三方面内容。同时良好的地理隔离环境和生物安全保障也是成功净化猪肺炎支原体的一个重要因素。

在对于阳性母猪群降低或减少对下一代仔猪的疫病垂直传播和水平传播的方法上，国内也有不少专家做过各种相应的研究，袁国华等利用自然分娩的方法也能够有效阻止猪肺炎支原体病原的传播[17]，这些方法都是基于不同疫病母源抗体为仔猪提供的被动免疫保护能力持续时间不同来实施的。而只有在母源抗体的有效保护时间内断奶并隔离饲养，才能切断病原的垂直传播。

最后，在建立本研究方法之前，我们建立了详尽的试验方案、优良的试验条件及相关的准备工作。从本试验结果来看，运用程序性用药、SEW和“三点式”生产体系技术培育猪气喘病阴性群的方法是可行的，此研究为猪肺炎支原体的净化提供了新的方法及事实论证。我们下一步研究计划是在推广该方法的同时继续简化各种操作程序及降低运行成本，以便更易于该方法的实际推广与运用。endprint

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