纺织技术构建组织工程肌腱支架的研究进展*

(东华大学纺织面料教育部重点实验室，上海，201620)

肌腱损伤是从事体育运动人群的常见损伤之一。肌腱损伤较难完全治愈，复发率高，且治疗成本较为昂贵，恢复周期很长。目前肌腱损伤的治疗方法主要有自体肌腱移植、同种异体肌腱移植和肌腱假体替代物三种方法，均存在某些弊端。自体肌腱移植存在肌腱供区缺损的问题，且供区肌腱多为无滑膜的肌腱，而严重影响功能的肌腱缺损多为有滑膜肌腱。同种异体肌腱移植若为具有活性的异体肌腱移植，会引起严重的免疫排斥反应；而经过冷冻干燥处理后的同种异体肌腱移植，则保存的仅是胶原纤维，将来仍需要自体肌腱细胞进行替代。人工肌腱假肢虽然近期生物力学强度较好，但远期终会发生降解，而且会引起感染致假肢排出体外。

随着材料学和生物医学的发展，组织工程肌腱移植有望成为永久性治愈肌腱损伤的理想方法。组织工程生物材料所形成的三维结构支架不但为细胞获取营养、生长和代谢提供了一个有利的空间，也为植入的细胞分泌细胞外基质并最终形成相应的组织或器官提供一个良好的环境[1-2]。因此，组织工程肌腱支架的研究是组织工程肌腱的重要研究内容之一。

1 组织工程肌腱支架设计

1.1 组织工程学概念及原理

20世纪80年代末，美国华裔科学家Fung Y C教授首次提出了组织工程学的命名，并于1987年被美国国家科学基金会采纳。1993年美国组织工程研究的先驱者麻省理工学院Robert Langer教授和哈佛大学Joseph Vacanti教授在《科学》杂志上发表了有关组织工程科学发展前景的文章[1]。此后，组织工程学在世界各国得到迅猛发展，成为医学生物研究领域发展最快的一门学科。

组织工程学是一门以细胞生物学和材料学相结合，进行体外和体内构建组织或器官的新兴学科。该学科的基本原理是：从机体获取少量的活体组织，用特殊的酶或其他方法将细胞(又称种子细胞)从组织中分离出来并在体外进行培养扩增，然后将扩增的细胞与具有良好生物相容性、可降解和可吸收的生物材料按一定的比例混合，使细胞黏附在生物材料上形成细胞—材料复合物；将该复合物植入机体的组织或器官病损部位，随着生物材料在人体内逐渐被降解吸收以及植入的细胞在体内不断增殖并分泌细胞外基质，最终形成相应的组织或器官，从而达到修复创伤和重建功能的目的[3]。

与其他传统方法相比，组织工程化人工肌腱修复缺损肌腱主要有以下优点[4]：

(1)所形成的肌腱组织有活力和功能，可对肌腱缺损进行形态修复和功能重建，并达到永久性替代；

(2)以相对少的肌腱细胞经体外培养扩增后，修复严重的肌腱缺损；

(3)按缺损肌腱形态任意塑形，达到形态修复。

1.2 组织工程肌腱支架的设计原则

组织工程的研究涉及种子细胞、生物可降解材料和组织构建三方面的内容。作为种植细胞支架的生物可降解材料，是对细胞外基质的仿生，是保证组织工程化形成的前提，必须具有细胞外基质的功能和作用。因此，组织工程用细胞支架一般应当具有以下一些性质[5-6]：

(1)良好的生物相容性。支架材料除满足生物材料的一般要求(如无毒、不致畸等)外，还要利于种子细胞黏附、增殖，降解产物对细胞无毒害作用，不引起炎症反应，甚至利于细胞生长和分化。

(2)良好的生物降解性。支架材料在完成支架作用后应能降解，降解速率应与组织细胞生长速率相适应，降解时间应能根据组织生长特性作人为调控。

(3)具有三维立体多孔结构。支架材料可加工成三维立体结构，孔隙率最好达90%以上，具有较高的面积体积比。三维立体多孔结构可提供宽大的表面积和空间，利于细胞黏附生长、细胞外基质沉积、营养和氧气进入及代谢产物排出，也有利于血管和神经长入。

(4)可塑性和一定的强度。支架材料应具有良好的可塑性，可预先制作成一定形状；具有一定的强度，可为新生组织提供支撑，并保持一定时间直至新生组织具有自身生物力学特性。

(5)良好的材料—细胞界面。支架材料应能提供良好的材料—细胞作用界面，利于细胞黏附、生长，更重要的是能激活细胞特异基因表达，维持正常细胞表型表达。

(6)良好的消毒性。支架材料应能适应简便而有效的消毒技术和方法，以利于组织工程构建前对支架进行彻底消毒。

2 组织工程肌腱支架形态

细胞支架不仅为特定细胞提供结构支撑作用，而且还起到模板作用，引导组织再生和控制组织结构。因此，在组织工程中，除了考虑材料的化学性质、表面性能外，还应考虑三维支架的结构，如结构形状，孔隙的形态、大小、连通性和孔隙率等，以便于细胞的黏附、渗透和营养物质的传送以及代谢产物交换等，而这些性质取决于肌腱支架的制备方法[7-8]。目前纺织结构常用的支架形态包括纤维状支架、管状支架和多元混构型支架等。

2.1 纤维状支架

2.1.1 三维分层纤维支架

通过传统的纺织技术容易制备多孔隙的织物，可用于组织工程肌腱支架。目前正在研发纤维积层技术和三维立体纺织技术来构建三维层状纤维结构支架。

Atsuyuki等[9]用直径为23 μm的聚左旋乳酸(PLLA，相对分子质量86 000)纤维为原料，制成平纹机织物(织物P)和双层结构织物(织物D，见图1)两种结构的织物。平纹机织物表面光滑，而双层织物一侧光滑，另一侧呈毛绒须条状。将两种织物分别植入兔子背部，对术后3和6 w时的织物组织学和力学性能进行研究。术后3 w，织物P纤维间细胞很少，而织物D光滑一侧有大量细胞黏附，另一侧有大量细胞向内迁移；术后6 w，织物P间隙迁移细胞很少，而织物D毛绒须条状一侧出现条状再生组织。在脱氧核糖核酸(DNA)数量上，织物D为(63.4±12.2) μg/cm2，而织物P为(14.6±2.2) μg/cm2。在力学性能方面：织物D断裂强力在术前为(24.3±0.9) N，3 w时为(32.0±4.2) N，6 w时为(23.6±5.4) N，最终强力仅下降3%，断裂功下降24%；织物P断裂强力在术前为(76.6±3.5) N，3 w时为(67±16.4) N，6 w时为(44.0±3.4) N，最终强力下降了43%，断裂功下降62%。之后，Atsuyuki等[10]又研究了无细胞双层PLLA支架在肌腱重建中的应用。将无细胞双层PLLA支架和原冈下肌肌腱分别移植到兔子冈下肌受损处进行修复，分别在术后0、4、8和16w时对其组织学和力学性能进行分析。术后4 w，支架毛绒状一侧间隙出现细长纺锤状细胞，并且支架内部出现纤维状组织；术后8 w，细长纺锤状细胞迁移到支架内部，再生组织与骨骼开始连接在一起；术后16 w，类似胶原的纤维组织出现在支架内部，并且部分纤维开始被吸收。支架在0、4、8和16 w时的断裂强力分别为(21.3±4.2)、(52±14.7)、(69±8.4)和(68.8±12.7) N，刚度分别为(2.6±0.46)、(7.8±2.5)、(8.1±2.5)和(11.1±3.1) N/mm；而原冈下肌肌腱在0、4、8和16 w时的断裂强力分别为(16.9±6)、(61.7±9.5)、(78±26.3)和(69.4±14.9) N，刚度分别为(2.42±0.32)、(7.3±2.6)、(11.0±3.1)和(10.2±1.4) N/mm。双层PLLA支架的断裂强力和刚度与正常肌腱组织没有明显差异，且细胞生长较好，因此Atsuyuki认为这种新型的双层PLLA支架具有诱导细胞向组织内部迁移的潜力，并且其力学性能与正常冈下肌肌腱类似。

Caliari等[11]以胶原—黏多糖为原料制成“芯—鞘”结构的双层复合支架[图2(c)]，其中：“芯”部由低密度、各向异性的胶原—黏多糖纤维

图1 双层结构织物D

束支架组成[图2(a)]；“鞘”部由高密度、各向同性的胶原—黏多糖薄膜组成[图2(b)]。双层复合支架“芯”部直径为6～8 mm，长度为15～30 mm，孔径为(243±29) μm，拉伸模量为(833±236) kPa；“鞘”部薄膜外径为12 mm，长度为45 mm，垂直纤维方向和平行纤维方向的拉伸模量基本相同，分别为(636±47)和(693±20) MPa。“芯”部的高孔隙率为细胞生长提供了环境，“鞘”部为支架提供足够强力，满足了多孔组织工程肌腱支架力学性能和生物相容性相结合的要求。

图2 “芯—鞘”双层复合结构肌腱支架

2.1.2 纤维黏接支架(非织造网孔支架)

将生物可降解纤维相互黏接在一起形成多孔性空间结构，为细胞生长和细胞间相互作用提供较大表面积[12]。

目前常用生物可降解材料聚乙交酯(PGA)的黏接技术有两种。一种方法由Mikos等[13]提出，将PGA纤维浸入PLLA溶液中，在溶剂蒸发后，两种聚合物形成复合物，此时PGA纤维网状物就嵌入到PLLA里；然后将复合物加热，随着PGA纤维的熔化，在交叉点的纤维会出现“焊接”现象，从而形成多孔载体材料(图3)。该支架材料的孔隙率可达到80%，孔径也能达到500μm。另一种方法是使用雾化的PLLA或聚乙交酯—丙交酯(PGLA)，先溶解在氯仿中，然后直接将其喷射到PGA纤维上。Mooney等[14]采用该方法将PGA材料制成管形，并将该管状材料植入小鼠组织中，17 d后观察到有纤维状组织生长，表明采用该材料制成的支架有可能促进新生组织的形成。

图3 纤维黏结支架的制备流程

2.1.3 非织造纤维支架

将PGA进行熔体纺丝得到长丝束，切断成短纤维后借助针刺技术制成非织造布。通过纤维直径和针刺后热压条件的改变，可在一定程度上调整支架的孔隙率和厚度。

George等[15]首先设计了非织造网状纤维支架力学模型，通过模型预测支架的拉伸强度和刚度，而后以PGA和PLLA纤维为原料，制作了PGA支架、PLLA支架及PGA/PLLA(50∶50)混合支架(图4)，通过实验测试了三种支架的拉伸强度和刚度。模拟所得PGA支架、PLLA支架和PGA/PLLA混合支架沿纤维轴向(PD)的刚度分别为306、168和222 kPa；而实验测得的PD刚度值分别为(284±34)、(171±14)和(206±16) kPa，且垂直纤维轴向(XD)刚度约为PD方向刚度的1/3。因此，George 认为通过结构模型能够预测所设计支架的刚度。

图4 非织造网状混合支架

2.1.4 静电纺纳米纤维支架

在一定条件下，受静电排斥力、库仑力和本身表面张力的共同作用，聚合物细流会沿着不稳定的螺旋轨迹弯曲运动，在几十毫秒内被牵伸千万倍，从而形成纳米级至亚微纳米级超细纤维[16]。在纳米混合支架中，由于纳米纤维比表面积大、孔隙率高，有利于细胞的黏附和细胞外基质的传递，并且纳米纤维与肌腱细胞外基质的天然纳米结构相似，能促进骨髓基质干细胞分泌肌腱特定的基质，而支架部分作为承受载荷的增强体。

Sahoo等[17]首先以PGLA(GA∶LA=90∶10)为原料，制备了纬平针结构的针织支架，然后利用静电纺丝技术将纳米纤维喷附在针织支架上，制成混合纳米微纤支架(图5)。该支架具有较大的比表面积，有利于细胞的黏附。纳米纤维直径为300～900 nm，支架厚度为0.8～1.3 mm，孔径为2～50 μm。对支架进行体外降解和力学性能测试，发现其初始拉伸断裂强力为(56.3±6.66)N，降解14 d后下降为(1.82±0.6)N；初始弹性刚度为(5.80±0.7)N/mm，降解14 d后为(0.64±0.1) N/mm。将猪的骨髓间充质干细胞(BMSC)接种到纳米纤维支架上，发现36 h后细胞就开始黏附在支架上，1 w时增殖细胞和细胞外基质混合良好，2 w时支架力学性能良好。该新型纳米混合纬编支架能够促进细胞接种、细胞增殖、细胞分化及细胞多样化，可以很好地应用在组织工程肌腱移植上。

图5 纬平针结构纳米微纤支架

Zhang等[18]研究了肌腱修复用仿生支架的功能性和整合性设计，强调肌腱移植的关键不仅在于移植支架具有较好的生物力学性能，并且能够促进正常腱—骨界面整合，通过使用纳米纤维或基于纳米纤维的复合材料支架可以实现组织工程肌腱修复的仿生设计。

Mathew等[19]以纤维素纤维为原料，制成了纳米纤维支架，并进行了生物力学性能实验。第一步将纤维素纤维溶解在溶剂中形成溶液，然后利用溶液制成纳米纤维，进而制成质量分数为0.5%的纳米纤维悬浮液，然后在100 ℃下烘干1 h，在60 ℃、35 MPa下处理6 h，即得纤维素纳米纤维网状支架NF0；第二步在完全真空容器中烘干NF0，再用15 mL等离子液在80 ℃下分别处理90和120 min，得到两种不同溶解度的纤维素纳米复合材料NF90和NF120。在室温条件下进行力学性能测试，NF0、NF90和NF120的拉伸强度分别为(105.9±5.5)、(112.2±6.5)和(117.9±6.6) MPa，模量分别为(6.6±0.5)、(8.2±0.8)和(6.8±0.6) GPa，断裂伸长率分别为(10.3±0.6)%、(7.4±0.8)%和(12.8±1.4)%，而正常肌腱的拉伸强度为28～38 MPa、断裂伸长率为18%～30%[20]，即纳米纤维支架强度明显优于正常肌腱，但断裂伸长率不满足使用要求。Mathew等[19]经过进一步研究发现，纳米纤维复合支架在模拟人体环境下测试的力学性能与室温下测量值存在差异。在人体环境下，NF0、NF90和NF120的拉伸强度分别为(64.5±4.9)、(36.2±3.3)和(37.4±2.8) MPa，断裂伸长率分别为(23.4±2.1)%、(21.3±3.8)%和(20.0±3.1)%，即强度和断裂伸长率都满足肌腱使用要求，并且细胞在几种支架上黏附、增殖、分化良好。因此，Mathew认为纤维素纳米纤维复合支架在肌腱重建中具有潜在的应用市场。

Li等[21]用聚己内酯(PCL)和PGLA作为原料，将碳酸钙粉末通过静电纺丝技术涂覆在纤维支架表面，形成梯度纳米纤维复合支架(图6)。将小鼠前成骨细胞(MC3T3)接种到梯度纳米纤维混合支架上，发现细胞在支架上黏附、增殖、分化良好，并且支架刚度较大。这种方法可以满足组织工程肌腱—骨连接修复要求，今后有望在临床中得到应用。

图6 梯度纳米纤维复合支架

Chen等[22]首先制作了一个针织蚕丝支架，将海绵状蚕丝填充在孔隙上，对支架进行钛纳米纤维(RADA16)涂层，得到混合支架(图7)。支架的孔隙约50～200 μm，将骨髓间充质干细胞(BMSC)接种到支架上，进行3 w的体外培养实验。与未进行RADA16涂层的支架相比，涂层支架上BMSC大量增殖，新陈代谢旺盛，细胞分化良好；细胞外基质中生腱蛋白含量明显增加，胶原蛋白和黏多糖增加，且最大拉伸载荷比未涂层支架高7%。这种钛纳米纤维涂层技术在韧带组织工程修复中具有潜在的应用市场。

2.2 管状支架

纤维状的材料在构建复杂型细胞支架时具有一定的优越性。纤维状支架的不足之处在于孔隙率和孔尺寸不易控制，亦不易独立调节。而管状支架具有结构稳定、孔隙率和孔径可调节等优点，已广泛应用于组织工程肌腱支架的构建。目前用于管状支架构建的纺织技术有编织，针织(纬编、经编)和非织造等技术。

2.2.1 编织类支架

编织是一组纱线沿0°方向延伸，而且所有纱线都偏移一个合适的角度，然后交织在一起形成织物的过程。肌腱呈束状，因此选用编织法作为肌腱支架的形成方式有其合理性。

图7 针织蚕丝钛纳米纤维复合支架

Coopera[23]以PGLA(GA∶LA=90∶10)长丝(5.78 tex)为原料，采用编织的方法编织韧带支架(图8)，并对支架进行了体外研究。研究表明，编织支架的极限抗张强度为100～400 MPa，应力—应变曲线与人体正常韧带组织相似。

图8 编织类支架

Lu等[24]分别以PGA、PGLA(GA∶LA=18∶82)、PLA长丝为原料，用圆形编织法分别制作了三种前交叉韧带支架(图9)。所得三种支架的编织角、表面积、孔隙率和平均孔径没有明显区别，支架孔隙率在54%～63%之间，平均孔径为177～226 μm，纤维直径为15～25 μm。

图9 圆形编织法编织支架

Tovar等[25]以聚芳酯(DTD DD)、Ⅰ型胶原蛋白为原料，采用圆形编织法编织聚芳酯/胶原(75∶25)混合支架(图10)，并进行了体内研究。将进行灭菌处理后的支架植入芬兰绵羊前交叉韧带受损处，在移植4和12 w后分别分析细胞内生长情况和支架的强力保持率。4 w后，混合支架的断裂强力由(944±162) N降为(314±11) N，刚度由(202±46) N/mm降为(86±4.4) N/mm；12 w后，混合支架结构完好，其断裂强力降为(42±22) N，刚度降为(9±3) N/mm。Tovar等指出，对于前交叉韧带重建，组织内生长是可降解支架获得成功的关键。

图10 编织类聚芳酯/胶原混合支架

2.2.2 纬编针织类支架

纬编是将纱线沿纬向喂入针织机的工作织针，顺序地弯曲成圈并相互穿套而形成针织物的一种工艺。与编织结构相比，纬编针织结构具有更高的孔隙率，能为组织向内生长提供更多的空间。

Ouyang等[26]以PGLA(GA∶LA=90∶10)为原料，制作纬平针结构针织支架，对针织复合支架在肌腱重建中组织学和生物力学性能进行了研究(图11)。首先制作三组支架：支架Ⅰ接种骨髓间充质干细胞(BMSCs)，支架Ⅱ不接种BMSCs，支架Ⅲ为正常肌腱；然后将三组支架移植到白兔受损肌腱处，进行12 w的重建手术。研究发现：术后2和4 w，支架Ⅰ比支架Ⅱ具有更好的组织结构和组织形态；而术后8和12w，支架Ⅰ与支架Ⅱ的形态与正常肌腱相似，且新生成的肌腱组织的成分主要是Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白；术后12 w，支架Ⅰ的拉伸刚度和模量分别达到正常肌腱的87%和(62.6±13.1)%，而支架Ⅱ的拉伸刚度和模量分别达到正常肌腱的56.4%和(52.9±13.8)%。

陶沙等[27]以PGA和PLA长丝为原料进行合股编织，将编织线在小口径圆筒针织机上进行纬平针织造，通过改变编织过程中弯纱深度、牵拉力和给纱张力等工艺参数，可以得到不同几何性能的纬平针支架，并对不同支架进行了体外降解实验。研究表明，弯纱深度、牵拉力和给纱张力都对支架的口径、孔隙率、密度和断裂强力有影响，且纬平针支架在降解过程中力学性能的衰减主要发生在前2 w，而质量损失在3 w后变化明显。

2.2.3 经编针织类支架

由于技术上的限制，将经编织物做成小孔径管状结构比较困难，因此对于经编支架目前仅限于平面结构的研究。Chen等[28]以蚕丝和胶原蛋白为原料制备了经编针织支架，支架孔隙大小约为1 mm×1 mm(图12)，将骨髓间充质干细胞(BMSC)接种到支架上进行动物体内实验。体内移植12 w后，支架拉伸强力下降了19.6%，从(46.5±9.2) N降为(37.4±3.8) N。通过扫描电镜观察到胶原海绵状微孔主要是蚕丝支架的孔隙部分，并且蚕丝和胶原蛋白相互黏结在一起。

图12 经编针织支架结构

2.2.4 中空纤维纺丝法

用中空纤维纺丝器可以制备中空纤维管。王光林等[29]用相对分子质量73万的生物可降解聚乳酸(PDLLA)和添加剂一起溶解在溶剂中，除泡后用中空纤维纺丝器通过干湿纺丝法，制成外径为213 mm、内径为119 mm、壁厚0.14 mm、长4 cm的管状物，然后进行充分洗涤，除去添加剂，制得孔隙率为70%、孔径为20～40 μm的中空纤维管(图13)。用该方法制得的中空纤维管可用于周围神经组织工程，但由于孔隙率和孔径相对较小，在肌腱组织工程上的使用还需作深入研究。

图13 中空纤维管状织物

2.3 多元混构型支架

使组织工程支架能具有时空匹配性的另一种方法是从宏观形态的组成结构入手，采用多元混构型可降解体系(DMBS)。DMBS支架可以定义为由可降解参数不同而几何尺度(直径、厚度)为1～100 μm的要素材料以特定方式排列形成的混合织构体系。要素材料的形态可以从长丝、短纤维，以及棒状体、片状体和扁条体等中选择。

Liang等[30]研究了冷冻片状脱细胞肌腱(DTSs)的力学性能和细胞黏附再生性。用核酸酶处理DTSs 12 h，测量其各项力学性能。DTSs拉伸强度、伸长率、拉伸模量和刚度分别达到正常肌腱的85.62%、123.61%、70.29%和93.07%；DTSs细胞外基质中超过93%的蛋白聚糖和生长因子被保存下来，并且DTSs促进了NIH-3T3型成纤维细胞的黏附和增殖。

3 问题与建议

3.1 面临问题

目前关于用组织工程的方法修复肌腱的研究类文献很多，很多学者认为组织工程技术将最终成为修复肌腱损伤的理想方法，但要想真正取得良好的临床效果，还需要解决多方面的技术问题。主要包括支架材料的降解速率与细胞功能化如何保持同步，如何构造模拟人体三维张力环境，如何同时使支架具有良好的生物相容性和良好的体内力学性能等。

3.2 研究方向建议

就目前组织工程肌腱支架的研究状况来看，短期内在支架材料上取得重大突破是非常困难的。建议今后可以开展以下几个方面的研究工作：

(1)研制新型合成材料和改性天然材料，使其成为符合要求的较为理想的支架材料。这是肌腱组织工程研究的一个重要方向。

(2)可以开发具有一定识别功能和特定修复功能的智能支架材料。这将成为当前生物材料研究的前沿课题。

(3)可以对现有不同特性的材料在支架中的合理分布和扬长避短进行研究，为最终满足支架同时具有良好生物相容性和力学性能提供一种可行途径[16,31]。

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