健脾益肺解毒方对肺癌A549/DDP耐药细胞周期的影响※

● 单爱云 曹 勇 马玉玲 曾秀娣 刘 敏 王莎莎



健脾益肺解毒方对肺癌A549/DDP耐药细胞周期的影响※

● 单爱云1曹 勇2▲马玉玲2曾秀娣2刘 敏2王莎莎2

目的：探讨健脾益肺解毒方药物血清对肺癌耐药细胞周期的影响。方法：将细胞分为荷瘤动物药物血清大、中、小剂量组，模型组，顺铂(DDP)组，维拉帕米(VRP)组，大、中、小剂量分别加DDP组和加VRP组。采用血清药理学及流式细胞术，观察健脾益肺解毒方药物血清分别与DDP和VRP合用后，对A549/DDP细胞周期的作用。结果：健脾益肺解毒方药物血清合用DDP和VRP后能协同DDP和VRP增加A549/DDP细胞G0/G1期细胞数，减少S期细胞比例(P<0.05)。结论：健脾益肺解毒方药物血清能协同DDP和VRP阻滞A549/DDP细胞于G0/G1期，阻止A549/DDP细胞DNA的合成，抑制肺癌耐药细胞的分裂增殖。

健脾益肺解毒方 细胞周期 A549/DDP细胞

健脾益肺解毒法是临床治疗肺癌的常用方法，临床发现健脾益肺解毒方药对肺癌中晚期和放化疗后均有确切的疗效，具有减轻化疗药物毒副反应、提高临床疗效、改善临床症状、提高生活质量、延长生存期作用，尤其对肺癌化疗前后及康复期配合健脾益肺解毒中药，疗效尤为明显。并且实验研究证实健脾益肺化瘀方对动物移植性肺癌具有抑瘤和化疗协同增效作用[1]。为了进一步明确健脾益肺解毒方对肺癌的作用，应用药物血清法，观察由党参、黄芪、猪苓、半枝莲、仙鹤草等单味中药免煎颗粒组成的健脾益肺解毒方对人肺癌A549/DDP耐药细胞周期的影响，以探讨健脾益肺解毒方对肺癌耐药细胞的作用机制。

1 材料

1.1药物健脾益肺解毒方免煎颗粒剂(由党参、黄芪、猪苓、半枝莲、茜草、仙鹤草等单味中药免煎颗粒剂组成)，深圳三九医药股份有限公司生产。用温蒸馏水配成相当于原生药材2g/ml的浓缩剂，置4℃冰箱备用。顺铂(DDP)，锦州九泰药业有限公司生产，10mg/瓶，批号050502；青霉素，哈药集团制药总厂生产，100万单位/瓶，批号0101002；链霉素，华北制药股份有限公司生产，100万单位/瓶，批号0101002；维拉帕米(VRP)，上海禾丰制药有限公司生产，2ml/5mg，批号4E12001。

1.2动物SPF级C57BL/6J小鼠，广东省医学实验动物中心提供，许可证号：SCXK(粤)2008-0002。

1.3瘤株Lewis肺癌，由广州中医药大学肿瘤研究所提供；人肺腺癌耐药细胞系A549/DDP，由第三军医大学新桥医院呼吸病研究所吴国明教授惠赠。

1.4试剂RPMI-1640细胞培养液，GIBCO；胎牛血清，杭州四季青生物工程公司；胰蛋白酶，GIBCO。

1.5仪器超净工作台，苏州净化设备有限公司；CO2孵箱，Thermo Forma；96孔平底细胞培养板，Corning；FACSCalibur流式细胞仪，美国BECKMAN-COULTER(贝克曼-库尔特)公司；倒置显微镜，Nikon；电子天平，FA2004型，Sartorius，德国。

2 方法

2.1荷瘤动物药物血清制备取健康C57BL/6J小鼠40只，体重18～22g，每鼠右前肢腋部皮下注射0.2ml小鼠Lewis肺癌组织悬液，24h后随机分为健脾益肺解毒方大、中、小剂量组和模型空白对照组，每组10只。健脾益肺解毒方大剂量组、中剂量组、小剂量组分别按30g·kg-1、20g·kg-1、10g·kg-1灌胃给药(分别为临床成人日用量的19.0倍、12.8倍和6.4倍)，模型对照组以等容积的生理盐水灌胃，每天1次，连续10d，末次灌胃1h，腹主动脉采血，无菌分离血清，经56℃30min灭活处理后，用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，置-20℃保存备用。

2.2细胞培养复苏后的人肺腺癌耐药细胞系A549/DDP，接种于50ml培养瓶，加入RPMI-1640培养液(含10%胎牛血清，青霉素、链霉素各100IU·ml-1)6ml，置于37℃、饱和湿度含5%CO2和95%空气的CO2孵箱中无菌培养，细胞呈单层贴壁生长，每2～3天更换培养液。

2.3细胞悬液的制备取对数生长期A549/DDP细胞，加入适量的0.25%胰蛋白酶液消化，PBS洗涤2次，离心，弃上清，用RPMI-1640培养液配制成2×105·ml-1细胞悬液。

2.4肺癌耐药细胞周期测定采用流式细胞术法。取对数生长期的A549/DDP细胞，0.25%胰蛋白酶消化计数，以2×105·ml-1的量接种于培养瓶中，37℃5%CO2培养24h，至细胞生长旺盛贴壁后，去掉培养液，换成不含胎牛血清的培养液。而后将细胞分为荷瘤动物药物血清大剂量组(简称大剂量组)，荷瘤动物药物血清中剂量组(简称中剂量组)，荷瘤动物药物血清小剂量组(简称小剂量组)，荷瘤动物模型血清组(简称模型组)，A549/DDP组(DDP组)，维拉帕米(VRP)组，大、中、小剂量分别加DDP组和大、中、小剂量分别加VRP组。大、中、小剂量组分别加入300μl终浓度为10%的不同剂量组含中药荷瘤动物血清；模型组加入终浓度为10%的荷瘤动物模型血清300μl；DDP组只加入终浓度为1μg·ml-1的DDP 300μl；大、中、小剂量分别加DDP组，同时加入300μl终浓度10%的不同剂量组含中药荷瘤动物血清和恒定浓度为1μg·ml-1的DDP各300μl；VRP组只加入终浓度为10μg·ml-1的VRP300μl；大、中、小剂量分别加VRP组，同时加入300μl终浓度10%的不同剂量组含中药荷瘤动物血清和恒定浓度为10μg·ml-1的VRP各300μl；每瓶终体积为3ml，不足部分加以RPMI-1640培养液。细胞培养液于CO2培养箱中，继续培养48h，然后分别离心，用PBS洗涤2次，制成细胞悬液。

收集不同因素处理的106个细胞，离心后PBS液洗涤，加入冰冷的70%乙醇固定，PBS液洗涤，加入PI荧光染液(50μg·ml-1PI，l0μg·ml-1RNA酶)4℃避光孵育30min，流式细胞仪分析DNA荧光强度，在流式细胞仪测定细胞的荧光强度，资料经计算机多正态拟合分析，得出细胞群体在细胞周期各个时相的分布比例。

3 结果

3.1健脾益肺解毒方荷瘤动物药物血清对肺癌A549/DDP耐药细胞周期的影响结果显示，DDP组及健脾益肺解毒方荷瘤动物药物血清大剂量组A549/DDP G1期细胞比例明显高于模型组(P<0.01)，而中、小剂量组无明显变化(P>0.05)。DDP组及健脾益肺解毒方荷瘤动物药物血清各剂量组A549/DDP S期细胞比例均明显低于模型组(P<0.01)；与DDP组相比，健脾益肺解毒方大剂量组G1期比例无明显变化(P>0.05)，中、小剂量组G1期比例明显低于DDP组(P<0.01)，而健脾益肺解毒方各剂量组S期比例均明显高于DDP组(P<0.01)，且健脾益肺解毒方在S期细胞分布高于G0/G1。见表1。

表1 健脾益肺解毒方药物血清对A549/DDP耐药细胞周期的影响

注：与模型组比较，1)P<0.01；与DDP组比较，2)P<0.01

3.2健脾益肺解毒方荷瘤动物药物血清与DDP合用时对肺癌A549/DDP耐药细胞周期的影响结果显示，健脾益肺解毒方药物血清各剂量组与DDP合用后，肺癌耐药细胞A549/DDP G1期比例均明显高于模型组和DDP组(P<0.01)，S期细胞比例均明显低于模型组和DDP组(P<0.01)。见表2。

表2 健脾益肺解毒方药物血清与DDP合用时对A549/DDP耐药细胞周期的影响

注：与模型组比较，1)P<0.01；与DDP组比较，2)P<0.01

3.3健脾益肺解毒方荷瘤动物药物血清与VRP合用时对肺癌A549/DDP耐药细胞周期的影响结果显示，VRP及健脾益肺解毒方荷瘤动物药物血清合用VRP后，各组A549/DDP G0/G1期细胞比例均明显高于DDP组(P<0.01)，S期细胞比例均明显低于DDP组(P<0.01)；健脾益肺解毒方荷瘤动物药物血清大、中、小剂量组合用VRP后，大、中剂量组A549/DDP G1期细胞比例均高于VRP组(P<0.05)，健脾益肺解毒方荷瘤动物药物血清各剂量组S期细胞比例均明显低于VRP组(P<0.01)。见表3。

表3 健脾益肺解毒方荷瘤动物药物血清与VRP合用时对A549/DDP耐药细胞周期的影响

注：与DDP组比较，1)P<0.01；与VRP组比较，2)P<0.05，3)P<0.01

4 讨论

化疗耐药是肺癌治疗不理想的原因之一。临床观察发现，肺癌中晚期和化疗后均有肺脾虚损的表现，尤其是肺癌化疗后尤为突出。我们根据中医五行相生理论，脾属土，肺属金，对肺癌化疗和中晚期采用健脾益肺为主以达培土生金，化瘀解毒为辅以治肺之癌瘤，收到了较好的临床效果。健脾益肺解毒方由党参、黄芪、猪苓、半枝莲、仙鹤草等药组成。现代药理学研究证明黄芪多糖可预防及减轻化疗后骨髓抑制，党参多糖具有免疫调节、抗肿瘤、抗病毒等作用，黄芪可明显抑制人肺癌细胞增殖，减少肺癌小鼠肺部转移，延长生存期，提高体内免疫功能[2-4]。猪苓多糖主要通过抗氧化、清除自由基，抑制肿瘤细胞增殖，诱导凋亡，影响肿瘤基因表达和增强免疫功能等方面发挥抗肿瘤作用[5]。中药半枝莲有抗突变、抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡、免疫增强、抗氧化、抑制端粒酶活性、抑制肿瘤血管生成等作用[6]。仙鹤草不论是对体外培养的肿瘤细胞，还是实验动物移植性肿瘤均有抑制或杀伤作用，尤其是在抑制瘤体增殖，促进癌症患者康复，改善临床症状，减轻放化疗的毒副作用，提高生存质量，阻止癌前病变，以及提高机体免疫功能等诸多方面，均有明显的效果[7]。表明健脾益肺解毒方的药物组成不但符合中医的组方原则，而且具有现代药理基础。

以南京宁芜铁路部分节点为例，结合绿道系统的打造，将原有跨内秦淮河的铁路桥保留再利用，改造成为慢行专用桥，串联起河道两侧的慢行空间，由此既落实了“面”与“线”层面城市绿道系统的构建要求，同时也提升了跨河慢行联系的连续性与安全性。

细胞周期反映了细胞的增殖过程，细胞周期长短主要决定于G1期，G1期阻滞可使细胞周期延长，增殖分裂减慢。恶性肿瘤的本质在于细胞周期的调节失控，出现无限制细胞增殖和分裂。现代医学研究表明，细胞周期的调控异常导致细胞的失控性增殖，是肿瘤发生和发展的重要特征，几乎所有的肿瘤都有细胞周期调控机制的破坏导致细胞生长失控、分化受阻、凋亡异常的特征[8]。

本研究结果显示，健脾益肺解毒方在S期细胞分布高于G0/G1，表明单用健脾益肺解毒方荷瘤动物药物血清不能阻滞A549/DDP细胞于G0/G1，从而使进入S期的细胞增加，对肺癌耐药细胞A549/DDP增殖无抑制作用。但是健脾益肺解毒方药物血清与DDP合用后，A549/DDP G1期比例均明显高于DDP组，S期细胞比例均明显低于DDP组，表明健脾益肺解毒方荷瘤动物药物血清与DDP合用后，具有协同DDP阻滞肺癌A549/DDP耐药细胞于G0/G1期，减少增殖细胞在S期的分布，从而减少肺癌细胞在S期DNA的合成，抑制肺癌耐药细胞增殖，逆转肺癌A549/DDP耐药细胞的耐药性，增强化疗敏感性。

维拉帕米(VRP)是一种钙通道阻滞剂，能与P-糖蛋白(P-gp)结合，抑制细胞毒性药物外排，使细胞内化疗药物浓度升高，细胞毒效应增强，对多药耐药具有逆转作用，极大地增加了肿瘤细胞对化疗药物的敏感性[9]。研究结果显示，健脾益肺解毒方药物血清与VRP合用后，A549/DDP G1期比例均明显高于VRP组，S期细胞比例均明显低于VRP组。说明健脾益肺解毒方荷瘤动物药物血清与VRP合用后，能协同增强VRP阻滞肺癌耐药细胞A549/DDP于G0/G1期，减少增殖细胞在S期的分布，从而抑制肺癌耐药细胞周期的增殖。由此认为健脾益肺解毒方药物血清抑制肺癌耐药细胞周期增殖的机理可能与增强细胞钙通道阻滞作用密切相关。

[1]孟 华，曹 勇，夏清华.健脾益肺化瘀方对小鼠Lewis肺癌作用的研究[J].时珍国医国药，2007(1)：11-12.

[2]郑召鹏，杨卫兵，李 宁，等.注射用黄芪多糖预防非小细胞肺癌化疗后骨髓抑制的疗效观察[J].中草药，2013，44(2)：208-209.

[3]杨 瑾，袁德培，陈龙全，等.党参多糖类成分抗肿瘤活性的研究进展[J].湖北民族学院学报(医学版)，2011，28(3)：67-68.

[4]吴朝妍，张莹雯，叶太生，等.NF-κB抑制介导的黄芪多糖抗人肺癌细胞效应[J].武汉大学学报(医学版)，2013，34(2)：174-177.

[5]刘洪超，蔡林衡，王淑英.猪苓多糖抗肿瘤机制研究进展[J].河南科技大学学报(医学版)，2011，29(3)：236-238.

[6]牛国晓，李 洁.半枝莲抗肿瘤机制研究进展[J].肿瘤防治研究，2012，39(2)：231-233.

[7]巴晓雨，何永志，路 芳，等.仙鹤草研究进展[J].辽宁中医药大学学报，2011，13(5)：258-261

[8]王 昕.细胞周期调控与肿瘤发生的研究[J].中国民康医学，2010，22(16)：2135-2136.

[9]李小兵.靶动脉灌注维拉帕米联合化疗药物介入治疗晚期肺癌的临床疗效分析[J].实用心脑肺血管病杂志，2013，21(12)：130-131.

中医故事

郎中对对子

民国时期，有个县太爷自以为是天下奇才，喜欢与人比咏诗作对。有一天下雨，县太爷硬要一个看病的郎中与他对对子。郎中无奈，也只好硬着头皮，等着县太爷出题。

县太爷以郎中打着的雨伞为题，道出一联：黑柄双雨伞；

郎中不会对对子，只好顺口打哇哇：银翘八宝盘。

县太爷说：“我出的上联是物件，你对的下联是药名，药名对物件……，嗯，马马虎虎。好!我再出一联你对对看。”说完，眼一瞄，见前面裁缝铺里师傅正拿着尺量布，就以其为题，道出一联：三尺天青缎；

郎中三句不离本行，又随口对出：六味地黄丸。

县太爷说：“你又是对的药名吧？你光对药名，我又不晓得到底有这些药名没有。这样吧，我再出一联，我以什么为题，你就以什么来对。”他说罢，头一偏，见路旁一户人家有个丫头正倚在门旁歪着脑袋朝外看人，就以这个丫头为题，摇头晃脑道出一题：小女子，红光满面，定知三从四德；

郎中心想：我对药，你又说不行；你看见人就出题，我又到哪里去找人来对呀？他愁眉苦脸地望着县太爷，蓦地心里一亮，有了，面前这位县太爷不是人吗？只见他盯着县太爷，察言观色，一字一句地说：大老爷，面黄肌瘦，必有五痨七伤。

县太爷正要发作，但转念一想，是自己出题要他对的，而且对得又工稳，真是哑巴吃黄连，有苦说不出。可他还是忍不住骂了声：小奴才!

郎中以为这又是县太爷出的上联，便脱口而出：大老爷!

县太爷面红耳赤，恼羞成怒，朝郎中大声呵斥：该死!

郎中还是以为县太爷在出对，又连忙对出下联：无救!

广东省科技计划项目(No.73062)；广州市科技计划项目(No.2007Z3-E5091)。

曹勇，男，教授。研究方向：中医肿瘤防治。E-mail:tcaoy@163.com。

1.广东省深州市福田区中医院(518034)；2.暨南大学医学院中医系(510632)

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