三七菊花速溶粉毒理学安全性评价

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1. 中国医学科学院 医学生物学研究所，北京协和医学院，云南 昆明 650118；2. 云南农业大学 植物保护学院，云南 昆明 650201；3. 云南白药集团文山七花有限责任公司，云南 文山 663000

三七菊花速溶粉毒理学安全性评价

白巍1普岳红2杨永红2*苏豹3

1. 中国医学科学院 医学生物学研究所，北京协和医学院，云南 昆明 650118；2. 云南农业大学 植物保护学院，云南 昆明 650201；3. 云南白药集团文山七花有限责任公司，云南 文山 663000

目的对以三七、菊花、乳糖等为原料生产的三七菊花速溶粉进行毒理学安全性评价。方法用小鼠急性经口毒性试验、Ames 试验、小鼠骨髓细胞微核试验、 小鼠精子畸形试验、大鼠30 d喂养试验等。结果经口急性毒性试验LD50>21.50g/kg.bw，属无毒级；Ames试验、小鼠骨髓嗜多染性红细胞微核试验和小鼠精子畸形三项遗传毒性试验检测均为阴性结果；30d喂养试验末期各项血液学指标、生化指标检测结果和肝、肾、脾、及生殖腺脏器系数值与阴性对照组无明显差异。大鼠体重变化、食物利用率正常，病理组织学观察结果表明肝、肾、胃、十二指肠及卵巢和睾丸均未见明显异常。传统致畸试验未见对胎鼠致畸效应或其它胚胎毒性作用。结论三七菊花速溶粉对动物的生长发育、造血功能、肝肾功能、器官组织均无明显毒性作用。

三七菊花速溶粉；毒理学；安全性评价；Amens试验

三七为五加科人参属植物的干燥根，主产于我国云南、广西，是我国传统名贵植物，具有滋补强壮、活血化瘀、消肿定痛的功能，经过现代医药研究证明：三七还能降血糖、降血脂，调节血压、抗疲劳、保肝、抗衰老和提高机体免疫功能。云南民间常用三七炖肉类或泡酒进行日常养生保健，三七汽锅鸡更是驰名中外的保健补品。因此，三七作为一种健康保健食品的利用，也是有着悠久传统历史的[1-4]。

三七总皂甙能扩张冠脉，增加冠脉流量，改善心肌缺血状态，减少心肌耗氧量，增加心肌收缩能力，因而可耐缺氧。三七总皂甙可阻滞肝细胞钙通道，抑制钙离子内流，防止氧自由基对肝细胞膜的脂质过氧化损伤，保护肝细胞膜和肝细胞，改善肝脏微循环功能，保证细胞器氧和营养的供给，提高肝细胞的解毒和排毒能力，减轻肝脏的损伤，促进肝细胞再生；抑制肝脏胶原合成，促进肝脏胶原降解，延缓肝纤维化的进程。对肝损伤均有预防与保护作用[5-8]。

菊花是一种重要的药用植物,具有抗菌、抗炎、抗氧化、舒血管、降血脂、抗肿瘤、驱铅等多种药理作用。菊花为菊科植物菊，含有挥发油、菊甙等十几种有效成分，可清心明目，解毒消炎，清热保肝。三七菊花速溶粉采用三七和菊花提取物，充分保留了其有效成份，使二者协同作用加强，根据相关药理学的研究确定产品配方[9-22]。本文对以乳糖、三七、菊花等为原料生产的保健品三七菊花速溶粉进行毒理学安全性评价。

1 材料和方法

1.1 样品 三七菊花速溶粉：云南**三七产业有限公司生产，送检样品为黄褐色细颗粒，推荐人体服用量为15 g/人/d。

1.2 试验动物及饲料 小鼠为昆明品系,大鼠为Wistar品系，由中国科学院昆明动物研究所提供(滇实动证第201014号和第201012号)。试验用的基础饲料根据饲料标准配制和加工。

1.3 急性毒性试验 按霍恩氏法进行剂量设计，分4个剂量组。三七菊花速溶粉用溶剂(蒸馏水)混匀后分两次灌胃，间隔2.5 h 。小鼠体重为：18～22 g，每次灌胃为 0.2 ml/10 g.bw，大鼠体重为 180～220 g，每次灌胃为 1.0 ml/100 g.bw。受试动物空腹灌胃。按2.15 g/kg.bw、4.64 g/kg.bw、10.00 g/kg.bw， 21.50 g/kg.bw.给小鼠灌胃。喂养观察72 h，直至14 d。按上述同样剂量给大鼠灌胃，灌胃后动物亦未出现有其他异常反应，喂养观察72h，直至14d。

1. 4 遗传毒性试验

1.4.1 Ames 试验 鼠伤寒沙门氏菌突变型菌株 - TA97、TA98、TA100和TA102四种。样品为厂家提供的三七菊花速溶粉。剂量设计为1250μg/皿、2500μg/皿、5000μg/皿、10000μg/皿及20000μg/皿。

加S9活化时，TA97、TA98、TA100菌株以2-AF作为阳性对照物，剂量10μg/皿; TA102以1,8-二羟蒽醌为阳性对照物，剂量50μg/皿。不加S9活化时，TA97、TA98 以敌克松为阳性对照物，剂量50μg/皿；TA100 以NaN3为阳性对照物，剂量1.5μg/皿。TA102以甲基磺酸乙酯为阳性对照，剂量1.0μl/皿。每个剂量组做三皿,重复一次,取三皿平均值。

1.4.2 小鼠骨髓多染性红细胞微核试验 用于微核试验的小鼠为昆明品系，体重 25～30g，♀性和♂性动物每组各5只。微核试验按“中华人民共和国国家标准,骨髓微核试验”GB 15193.5-94标准进行。动物分组:四个剂量组, 为2.69 g/kg.bw; 5.38 g/kg.bw ，10.76g /kg.bw和21.5 g/kg.bw。另有溶剂对照组及环磷酰胺(40 mg/kg.bw)阳性对照组。实验组及对照组两次给予受试物,灌胃量为0.4 ml/20g, 间隔 24 h,第二次给受试物后6 h 颈椎脱臼处死动物，取胸骨骨髓制片，甲醇固定，Giemsa 染色 (pH=6.47)。观察骨髓多染性红细胞微核，以千分数(‰)表示之。

1.4.3 小鼠精子畸形试验 用于小鼠精子畸形试验的动物为昆明品系雄性小鼠，体重为25～35 g, 每组5只。实验动物由中国科学院昆明动物研究所提供(滇实动证第201012号)。小鼠精子畸形分析实验操作按“中华人民共和国国家标准,小鼠精子畸形试验”GB 15193.7-94标准。

1.5 30 d喂养试验 选用健康断乳Wistar 品系大白鼠80只。体重为 60～65 g，每组各20只，雌雄各半。第1组为对照组，2～4 组为实验组，低、中、高剂量组分别 6.25 g/kg.bw,12.5 g/kg.bw 和25 g/kg.bw(相当于人日摄入量的25倍、50倍和100倍)。对照组喂基础饲料,各剂量组在基础饲料中分别掺入6.25%、12.5%和25%受试物,分笼饲养,自由摄食。观察如下指标：

1.5.1 动物体重变化与食物利用率，每周称一次体重并计算食物利用率。

1.5.2 血液学检查 在实验结束期(30 d)进行红细胞(RBC)计数，白细胞(WBC)计数，血红蛋白 (Hb)测定，血小板计数及白细胞分类计数。

1.5.3 血液生化指标测定 实验终了时取禁食大鼠尾静脉取血作总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、谷丙转氨酶(ALT/GPT)、谷草转氨酶(AST/GOT)、肌酐(CRE)、葡萄糖(GLU)、胆固醇(CHO)、尿素氮(BUN)、白蛋白/球蛋白、球蛋白及甘油三酯测定。

1.5.4 脏器系数值测定 处死动物前称重，处死后取肝、肾、脾及生殖腺称重，计算脏体比值。

1.5.5 病理组织学观察 处死动物，解剖作肉眼观察，取肝、肾、胃、十二指肠、卵巢和睾丸用10%的福尔马林固定，石蜡切片，H.E.染色作组织形态学观察。

1.5.6 统计 采用SPSS 统计软件处理。

1.6 传统致畸试验 实验动物:大鼠 Wistar品系，雌雄性均为性成熟。体重为200～230 g。雌雄鼠各80只，由中国科学院昆明动物研究所提供(滇实动证第201014号)。剂量分组：高剂量组为21.5g/kg、中剂量组10.75 g/kg、低剂量组5.38 g/kg。溶剂蒸馏水为对照组。受孕动物检查和给受试物时间：性成熟雌雄大鼠按1∶1同笼，检出阴道栓或精子判定大鼠交配成功当日作为受孕0d。检出的孕鼠随机分到各组同时称重、编号。在大鼠受孕的第7-16 d，每天经口给予受试物，按1 ml/100 g计算灌胃量(其中高剂量组两次灌胃，每次3ml)，在受孕的0, 7, 12, 16, 20 d称体重，并计算摄入受试物的量。孕鼠的处死和检查：大鼠于妊娠的20 d开始脱颈锥处死，剖腹取出子宫称重，记录并检查胚胎数、黄体数、着床数、早期吸收胎、迟死胎及活胎数。活胎鼠检查：逐一记录胎仔重量、体长。记录。胎仔检查：在体视显微镜下作整体观察，然后逐步检查骨骼。胎鼠内脏检查:每窝的1/2胎鼠放入Bouins液中,固定两周后作内脏检查。先用自来水冲去固定液，将鼠仰放在石蜡板上，剪去四肢和尾，用刀片从头部到尾部逐段横切或纵切。按不同部位从头开始，往下逐渐经颈、胸腹部作检查，观察器官大小,形状和相对位置等。

2 结果与分析

2.1 急性毒性试验 小鼠及大鼠经口急性毒性试验结果表明：在观察期间各组小鼠和大鼠均未见异常反应，无死亡。小鼠、大鼠经口LD50大于21.50 g/kg,根据急性毒性试验毒性剂量分级标准为无毒级。

2.2 遗传毒性试验

2.2.1 Ames 试验

表 1 三七菊花速溶粉对大鼠、小鼠的急性毒性

表2 三七菊花速溶粉Ames试验掺入法结果±SD)

注：以上结果为3个平皿的均值±标准差

三七菊花速溶粉在1250～20000μg/皿的剂量范围内，无论加与不加S9各菌株诱发回变菌落数未出现阳性致突变结果。三七菊花速溶粉在本试验条件下无致突变作用。

2.2.2 小鼠骨髓多染性红细胞微核试验

表3 三七菊花速溶粉对小鼠骨髓嗜多染性红细胞微核发生率的影响

经卡方检验,溶剂对照组与阳性对照组相比有极显著性差异，而溶剂对照组与各试验 组相比，P>0.05,均无显著性差异,表明该受试物不诱发微核率增加。

2.2.3 小鼠精子畸形试验结果

表4 三七菊花速溶粉对小鼠精子畸形发生率的影响

小鼠精子畸形统计用χ2检验， 阳性对照组与溶剂对照组相比，结果：χ2=59.990, 有极显著性差异。各试验组与溶剂对照组相比,均无显著性差异。结果表明该受试物在本剂量范围内未发现对生殖细胞有诱变作用。

2.3 30d喂养试验 在30 d喂养整个试验过程,各组动物状况良好,未发现有中毒症状,亦无动物死亡，本次实验所作的各项指标表明三七菊花速溶粉安全无毒。

2.3.1 三七菊花速溶粉对大鼠体重的影响

2.3.2 三七菊花速溶粉对大鼠总食物利用率和体重增重的影响

表5 三七菊花速溶粉喂饲大鼠 30 d的体重(g)变化±SD)

表6 三七菊花速溶粉对大鼠总食物利用率和体重增重的影响±SD)

受试物各剂量组对雌、雄性大鼠的体重增重、进食量和食物利用率与对照组相比，均无显著性差异( 体重增重、进食量与对照组相比，统计量值分别为雌F=0.101,P=0.959;F=0.068,P=0.977; 雄F=0.188,P=0.904,F=128,P=0.943)。食物利用率统计量值见表6。

2.3.3 不同剂量的三七菊花速溶粉对大鼠30 d喂养试验血液学指标的影响

2.3.4 三七菊花速溶粉对大鼠30 d喂养试验白细胞分类的影响

2.3.5 三七菊花速溶粉对末期生化指标检查结果

表8 三七菊花速溶粉喂饲大鼠30 d的血液学指标观察±SD)

*经t检验,对照组与各试验组相比均无显著性差异。

表9 三七菊花速溶粉大鼠 30 d喂养试验对白细胞分类的影响±SD)

表10 三七菊花速溶粉喂饲大鼠 30 d血液生物化学指标检查±SD)

*经t检验，对照组与各试验组相比均无显著性差异。

2.3.6 三七菊花速溶粉对大鼠脏体比的影响

表 11 三七菊花速溶粉喂饲大鼠 30d肝、肾、脾和生殖腺脏体比的影响±SD)

各组的脏器系数值与对照组相比无显著性差异。

2.3.7 病理组织学检查结果 大体解剖各组大鼠各脏器，未见明显异常：组织学检查大鼠肝脏、肾脏、胃、十二指肠、卵巢和睾丸等脏器；肝小叶结构完整，细胞排列规整，未见肝细胞出现变性、坏死等病变；肾小球无异常，曲管上皮、髓质、肾盂无特殊发现；胃粘膜完整，未见上皮细胞脱落及溃疡；睾丸和卵巢发育无异常。三七菊花速溶粉的高、中、低剂量组与溶剂对照组比较，经对各组的20只大鼠的肝脏、肾脏、胃、十二指肠、卵巢和睾丸等脏器经组织病理学检查，除高剂量组有一只大鼠肾脏有散在钙盐沉着外，其他未出现充血、出血、变性、坏死、炎变，未发现与实验有关的病变。

2.4 传统致畸试验

2.4.1 三七菊花速溶粉对孕鼠体重变化的影响

2.4.2 三七菊花速溶粉对胎鼠体重和身长的影响

表12 三七菊花速溶粉对孕鼠体重变化的影响±SD)

*溶剂对照组为蒸馏水

表13 三七菊花速溶粉不同剂量对胎鼠体重和身长的影响±SD)

2.4.3 三七菊花速溶粉对母鼠着床数和活胎数的影响

表14 三七菊花速溶粉对母鼠着床数和活胎数的影响

2.4.4 三七菊花速溶粉对母鼠增重的影响

根据下列公式计算妊娠母鼠增重：

妊娠期母鼠增重=处死时母鼠体重-妊娠第7 d体重-处死时子宫重(包括胎鼠重)

表15 三七菊花速溶粉对母鼠增重的影响

经F检验, F值=0.037, 值=0.990,组与组间无显著性差异。

2.4.5 三七菊花速溶粉对胎鼠骨骼发育的影响

表16 三七菊花速溶粉对胎鼠骨骼发育的影响

溶剂对照组与各实验组相比无差异。

2.4.6 三七菊花速溶粉对胎鼠内脏的影响

表17 三七菊花速溶粉对胎鼠内脏的影响

传统致畸试验结果表明：各组孕鼠体重增长正常，胎鼠形成、骨骼发育、内脏形成均无异常，无致畸作用。

3 讨论

三七是中国特有的名贵中药材，也是我国最早的药食同源植物之一。现代药理研究证明其增强机体免疫功能，抗肿瘤；止血、活血化瘀；保肝、抗炎；延缓衰老；双向调节血糖、降低血脂、胆固醇、抑制动脉硬化,促进蛋白质、核糖核酸(rna)、脱氧核糖核酸(dna)合成，强身健体；促进血液细胞新陈代谢，平衡调节血液细胞；镇静、延缓衰老PNS及PDS可延长果蝇平均寿命，提高飞翔能力，降低头部脂褐素含量。PNS及PDS小鼠皮下连续注射30天，可显著提高血清、脑组织SOD活性，减少心、肝、脑组织中MDA的生成。三七粉大鼠灌胃给药可显著提高脑组织中SOD活性，减少LPO的生成。此外，三七醇提物还能促进小鼠脑内DNA、RNA和脑蛋白质的合成。对免疫功能的影响、对代谢的影响，三七对糖代谢有双向调节作用。另，三七对记忆获得障碍，记忆巩固障碍有一定改善作用；PNS对家兔失血性休克有一定疗效；三七皂苷A对大鼠有一定的利尿作用[1-8]。

菊花在中医临床上为常用中草药，我国已有300 多年的栽培药用史。具有散风清热、平肝明目之功效，用于治疗风热感冒、头痛眩晕、目赤肿痛、眼目昏花。菊花化学成分主要是挥发油、黄酮类、氨基酸、微量元素和绿原酸等。《本草备要》记载：“菊花味兼甘苦，性禀平和，备受四气，饱经霜露，得金水之精，益肺肾二脏”；《本草纲目拾遗》记载：“治诸风头眩，明目祛风，搜肝气，益血润容”[15-22]。

应用现代生物技术，将三七和菊花活性成分有机结合，起到协同作用，具有扩张血管、降低血压，改善微循环，增加血流量，预防和治疗心脑组织缺血，双向调节中枢神经，提高脑力，增强学习和记忆能力；有抗菌、抗炎、抗氧化、舒血管、降血脂、抗肿瘤、驱铅等多种药理作用，而且速溶粉携带、服用方便。本文严格按照《中华人民共和国国家标准 GB15193.3、4、5、7、13、14-1994》检验，各项指标均符合标准，进一步说明配方、配比合理。

4 结论

通过毒理学及安全性评价，三七菊花速溶粉经口急性毒性试验LD50>21.50g/kg.bw，属无毒级；Ames试验、小鼠骨髓嗜多染性红细胞微核试验和小鼠精子畸形三项遗传毒性试验检测均为阴性结果；30d喂养试验末期各项血液学指标、生化指标检测结果和肝、肾、脾、及生殖腺脏器系数值与阴性对照组无明显差异。大鼠体重变化、食物利用率正常，病理组织学观察结果表明肝、肾、胃、十二指肠及卵巢和睾丸均未见明显异常。传统致畸试验未见对胎鼠致畸效应或其它胚胎毒性作用，表明该受试物无明显毒性作用。

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TheEvaluationofToxicologyandSafetyaboutNotoginsengChrysanthemumInstantPowder

BAI Wei1, PU Yue-hong2, YANY Yong-hong2*, SU Bao3

1. Institute of Medical Biology, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Kunming 650118 , Yunnan, China 2. Department of Plant Protection, Yunnan Agriculture University, Kunming 650201, Yunnan, China 3. Yunnan Baiyao Group Wenshan Qiua Limited Company, Wenshan 663000, Yunnan, China

AIM To assessment the toxicological safety of a new health care products, the notoginseng chrysanthemums instant powder which made from lactose, notoginseng, chrysanthemum and other raw materials.METHODSUse acute oral toxicity test in mice, Ames test, Mouse bone marrow cells micronucleus test, Mouse sperm malformation test and 30 d feeding test in rats.RESULTSThe notoginseng chrysanthemum instant powder to female and male mice acute oral toxicity MTD is greater than 30 000 mg/kg. There is no inducing micronuclei bone marrow eosinophils dyed red blood cell micronucleus test in mice. Mouse sperm malformation test did not be seen and malformation rate of sperm deformity did not be caused. There is no mutagenicity about Ames test under the condition of with and without the S9. Poisoning was not observed in 30 d rat feeding test.There was no significant difference were observed between notoginseng chrysanthemum instant powder each dose group and the blank control group comparison (P>0.05) about animal body weight, food utility rate, hematology and blood biochemical indexes,each viscera organs/Volume ratio.Main organs on the morphological and histological appearance no abnormal change.CONCLUSIONnotoginseng chrysanthemum instant powder had no obvious toxicity on animal growth, hematopoietic function, kidney function and organ tissue and so on.

notoginseng chrysanthemum instant powder; toxicology; safety evaluation

杨永红(1965-)，女，教授，博士后，主要从事中药资源及其相关研究。E-mail: yyh831994@163.com

R284.1

A

1007-8517(2014)05-0013-06

2013.12.06)