结直肠癌细胞中RAD18与FANCD2蛋白相互作用的实验研究*

乐贻军 王 红 钟雄平 刘 超 陈业金

广州医科大学附属广州市第一人民医院消化科(510180)

范可尼贫血(FA)是一种常染色体或X染色体连锁的隐性遗传性疾病，在各人种中均有发现，FA患者的主要特征是骨髓造血功能障碍、先天性畸形以及对肿瘤易感性升高[1-2]。迄今已发现与FA疾病相关基因15个，一旦这些基因出现突变就会出现FA或类似FA的综合征[2]。由这些基因编码的蛋白共同组成了所谓的FA通路，目前大量研究显示该通路主要对DNA的交联损伤起修复作用，对维持细胞染色体稳定具有重要作用[2-3]。FANCD2蛋白泛素化被认是FA DNA损伤修复通路中重要的激活步骤[2]，近年来其在肿瘤中作用的研究越来越多。我们的前期研究已经证明在结直肠癌SW480细胞中通过siRNA干扰RAD18，可抑制FANCD2蛋白泛素化并增强其对丝裂霉素的敏感性[4]，表明RAD18在SW480细胞中具有调节FANCD2泛素化的功能。但RAD18对FANCD2蛋白的调节作用是直接还是间接以及作用位点如何都有待进一步研究。本实验采用免疫共沉淀技术以及GST pull-down技术对两者间的相互作用关系进行初步验证。

材料与方法

一、主要材料

结直肠癌SW480细胞由南方医科大学消化病研究所提供并由本实验室保存，pGEX-4T-RAD18重组表达载体和pGEX-4T-1质粒均由广州纽克利公司负责构建并经测序鉴定正确，BL21感受态细胞购自广州微科生物技术有限公司。RAD-18抗体、FANCD2抗体由Santa Cruz公司提供，兔IgG抗体、琼脂糖珠子、HRP二抗由Bioworld公司提供。GST融合蛋白纯化珠由生工生物工程(上海)股份有限公司提供。

二、方法

1. 细胞培养：SW480细胞置于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/L链霉素的RPMI-DMEM高糖培养基中，按时传代培养。……