关于腰椎间盘退变过程中基质金属蛋白酶-13的来源

胡宝山 许喜筠 郭元利 芮 钢

(厦门大学附属第一医院骨科，福建 厦门 361003)

椎间盘退变的病因和发病机制是近年来的研究热点，目前发现退变椎间盘中，均有细胞因子和炎症介质等物质存在，但细胞因子和炎症介质在椎间盘内的来源未见相关报道。本实验旨在观察椎间盘细胞受到诱导刺激能否自分泌产生基质金属蛋白酶(MMP)-13，进一步揭示退变椎间盘中MMPs的来源。

1 材料与方法

1.1材料 新西兰大白兔40只，平均体质量2.6 kg，雌雄不限，由厦门大学实验动物部提供。主要试剂：120 kD纤维黏连蛋白(Fn，美国Chemicon公司)，TRIzol 试剂(美国MRC公司)，M-MLV逆转录酶(美国Promega公司)，5×M-MLV 缓冲液、RNA酶抑制剂、100 bp DNA Marker、5 mmol/L dNTP Mixture、TaqTMDNA聚合酶(TaKaRa中国大连公司)。主要仪器：OLYMPUS CX-40显微镜(日本Olympus光学工业株式公司)，Gyroscan intera T 1.5磁共振仪(德国Philip公司)，高速离心机(德国Philip公司)。

1.2椎间盘细胞的分离和培养 新西兰大白兔，空气栓塞处死。无菌取椎间盘，刮除髓核并削除纤维环，显露软骨终板并用小刀片及剪刀小心削剪软骨终板，将软骨终板和纤维环组织分别放入盛有无血清培养基的培养皿中，离心得到软骨终板细胞和纤维环细胞，加入10 ml DMEM/F12培养基吹打均匀后转移到75 cm2培养瓶中在37℃、5% CO2的培养箱中培养。原代软骨终板细胞大概10 d左右融合，原代纤维环细胞大约8 d融合，之后每3天换液1次，按时用倒置显微镜观察、拍照。细胞增殖融合为单层几乎覆盖瓶底时用0.25%胰蛋白酶消化并进行细胞传代。两种细胞一般均为8 d左右传代。因椎间盘髓核细胞经多次培养只能原代成活，无法进行传代，未进入实验。……