DNMT3B启动子区SNP(-579G/T)与佳木斯肺癌发病风险的相关性

张淑红 王茉琳 戚家峰 刘 爽 杨欣艳 张 虎

(佳木斯大学，黑龙江 佳木斯 154007)

肺癌是发病与多种因素如吸烟、遗传、癌基因的激活及抑癌基因的失活等相关，关于肺癌的病因学、预防、诊断、治疗等研究已经成为研究领域的重要课题〔1〕。已有研究表明遗传因素在肺癌的发生、发展、治疗反应、预后等环节中具有重要的作用，因此开展肺癌的遗传研究对于肺癌易感人群的筛查、治疗方法的选择、预后判断等都具有重要的意义。单核苷酸多态性(SNP)应用于肺癌的关联研究，是肺癌研究领域中较为活跃的内容之一〔2〕。已有文献表明，肺癌易感性与某些SNP位点有相关性〔3〕。DNA甲基化是由DNA甲基转移酶(DNMTs)介导的，DNMT3A与DNMT3B 的功能是产生新的甲基化型。在肿瘤中，启动子CpG岛高甲基化是最常见的表观遗传学改变，在人类各种肿瘤中都有发现，并和异常的基因转录沉默相关〔4〕。SNP、DNA甲基化与肿瘤三者之间的关系就已经有相关报道〔5〕。本研究旨在探讨DNMT3B基因启动子区SNP-579G/T位点与肺癌发病易感性之间的关系。

1 材料和方法

1.1材料 病例组选自佳木斯大学第一附属医院、佳木斯市肿瘤医院的肺癌血液样本98例，男68例，女30例，年龄53～70(平均61.0)岁病例的临床资料完整。血液标本采集前均没有抗肿瘤药物的使用记录。对照组为健康人血液样本105例，男60例，女45例，年龄55.0～64.0(平均69.5)岁。其中性别、年龄等与病例组相匹配，见表1。两组人群都是佳木斯地区汉族人群，个体之间均无血缘关系(P>0.05)。

1.2方法

1.2.1全基因组DNA抽提 采集静脉全血2 ml，运用DNA提取试剂盒提取基因组DNA，分别提取肺癌患者、健康对照组外周血，提取的DNA溶解于pH8.0 的TE中，4 ℃保存。

1.2.2PCR 引物序列如下：上游5′CAGGTCTCATTATGCCTAGG-3′(nt 1533753-1533772)，下游5′GGGAGCTCACCTTCTAGAAA-3′(1533977-1533958)，扩增产物225 bp。单管反应体系25 μl包含dNTPs 0.1 mmol/L，上下游引物各10 pmol，Taq DNA聚合酶1.25 U，DNA 1.0 μl(100 ng)。95 ℃预变性5 min；95℃ 20 s，56℃20 s，72℃20 s共30个循环，最后72 ℃延伸10 min。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳，溴乙啶染色，紫外灯下观察。

1.2.3限制性内切酶pvuⅡ酶切反应 20 μl酶切反应体系含10×缓冲液2.0 μl，pvuⅡ(TaKaRa公司)4 U，PCR产物2.0 μl，混匀后37℃水浴中酶切过夜。酶切产物于2%琼脂糖凝胶电泳分析基因型。选择凝胶电泳证实为 GT基因型，经双脱氧终止法测序。

1.3统计学处理 采用SPSS13.0软件进行χ2检验。

2 结 果

2.1DNA电泳 采集研究对象EDTA抗凝的外周血，运用基因组提取试剂盒提取全基因组DNA，部分结果如图1所示。

2.2PCR-RFLP分析DNMT3B基因启动子区SNP位点(-579G/T) PCR产物225 bp，Marker为puc19，其片段大小由上至下依次为：501、403、331、242、190、147、110 bp。如图2所示。经限制性内切酶pvuⅡ酶切，酶切产物为132 bp和93 bp，部分结果如图3所示。-579G/T位点PCR-RFLP分型结果经测序验证，利用BLAST与基因DNMT3B全序列(GeneID：1789 NC000020.9)进行比对，如图4，图5。

2.3-579G/T位点基因频率分布 -579G/T位点在肺癌病例组和正常对照组中基因型分布无显著差异(P>0.05)，见表1，经统计学验证两个群体均为遗传平衡群体。-579G/T位点与肺癌发病风险估计无统计学意义〔P=0.991 3，OR(95%CI)=1.003 6(0.521 6～1.931 0)〕。

图1 部分模版DNA提取电泳图

1～3:PCR产物

表1 DNMT3B(-579G/T)基因型和基因频率分布〔n(%)〕

3、5、7：杂合子GT，其余泳道为纯合子TT

图4 GT杂合子测序图

图5 TT纯合子测序图

3 讨 论

SNP是指DNA多态性在人群中的分布频率大于1%的可遗传性的变异。研究表明，位于基因启动子区的SNP能影响基因的表达或酶的活性〔6〕。本研究所得DNMT3B基因启动子区多态性位点-579G/T该位点与佳木斯地区肺癌的易感性无显著相关性，且两组中均为检出GG基因型个体。

DNMT3B基因的SNP位点与疾病的关联研究已见报道，目前集中在某单个的位点及某些单体型的研究，且各个位点在人群中基因型的分布及SNP位点与疾病的相关性具有民族性、区域性的差异。文献报道表明DNMT3B启动子区 C46359T的CT+TT基因型所患肺癌的风险几乎是CC基因型的2倍〔7〕；Hu等〔8〕采用PCR-RFLP 和DNA 测序的方法，对259例胃癌患者和262位健康对照人群的DNMT3B启动子区SNP-149C/T 和-579G/ T位点进行分析，结果表明，-579G/ T 位点与胃癌易感性相关，携带G 等位基因的个体较TT 基因型个体患胃癌的易感性低，且该位点基因型在中国人、韩国人和美国人中的分布不同。由此可说明，基因多态性因人群、种族以及地域分布的不同而存在差异，进而导致不同人群对肿瘤易感性的差异。Srivastava等〔9〕研究表明DNMT3B启动子-579G/ T位点与印度北部地区胆囊癌的易感性无显著相关性。

与肺癌发病相关的多态性位点已有文献报道，例如Wang等〔10〕首次研究了CYP2A13常见多态性位点rs8192789(Arg257Cys)与中国汉族人群的肺癌易感性，研究发现该位点与肺腺癌具有相关性，CT+TT基因型较CC基因型降低了腺癌的易感性。之后法国的研究者〔11〕研究了高加索人群另一个多态性位点(Arg101Stop)与肺癌易感性的关系，研究发现该位点与小细胞肺癌具有相关性。D'Agostino等〔12〕研究发现多态性位点CT或TT基因型(Arg257Cys)的CYP2A13明显降低了对烟草前致癌物的代谢，与Wang的研究结果是一致的。Zhang等〔13〕研究了p53常见多态性位点rs1042522、Arg72Pro与肺癌易感性的关系，结果发现在高加索人群中携带Pro72Pro基因型的个体的肺癌的易感性增加。Mechanic等〔14〕从单体型水平上研究了高加索人群和非洲人群中p53基因多态性与肺癌易感性的关系，他在对p53基因进行整体分析的基础上选择了16个常见SNP，包括标签SNP(tagger SNP)和功能性SNP，结果发现rs1042522、rs9895829、rs2909430、rs1625895、rs12951053在非洲人群中与肺癌易感性以及预后有关联，而由rs1042522、rs9895829、rs2909430、rs1625895组成的一个单体型OR值达到2倍以上。Sauter等〔15〕的研究也发现了在高加索人群中MMP1的常见多态性与肺癌的发生具有相关性。本实验室在前期的研究中表明，DNMT3B基因启动子区多态性位点-149C/T与本地区肺癌的发生无相关性〔16〕。

总之，关于SNP与肺癌易感性的研究已经成为肺癌遗传学研究领域中的一个热点，大量的研究发现了可能与肺癌发生具有关联的易感性SNP，这些有关联的SNP理论上有望成为筛选肺癌易感人群的分子标志物。从基因多态性与肺癌易感性关系着手研究，可以从基因的水平解读种族间肺癌易感性的差别，为易感者的筛选，肺癌早期诊断提供遗传标记。研究这种不同个体间基因的差异对于肺癌的临床个体化治疗的实施具有重要意义。本实验室在研究DNMT3B基因启动子区-149C/T位点的基础上继续研究-579G/T位点，也是对DNMT3B基因的SNP-579G/T多态性在佳木斯地区基因型分布及其与肺癌发生关系的初步探索，由于样本量不大，再加上有些基因型在人群中的分布比例较小，所以不能完全确定DNMT3B基因-579G/T多态性与肺癌易感性无关。可在此实验基础上继续加大样本进行按吸烟、病情分期、分层来探讨两者间的关系，同时需要做SNP单体型的研究。至于该基因的SNP位点与其他肿瘤易感性的关系，尚需进行更深入的研究，加以阐明。

SNP将帮助人们认识复杂的多基因疾病，如癌症、糖尿病、血管性疾病和某些精神性疾病〔17〕，影响这些疾病的基因很难用传统方法确定。而SNP和药物或疾病的易感性相关，使其能在攻克癌症方面有所作为，这对肿瘤药物的开发和分子靶向治疗都有很大的促进作用。随着对表观遗传与遗传变异研究的不断深入，SNP将为肿瘤易感性预测、预防及治疗带来新启示。

4 参考文献

1Jemal A，Siegel R，Ward E，etal.Cancer statistics〔J〕.CA Cancer J Clin，2009;59(4)：225-49.

2滑 峰，周清华.肺癌相关单核苷酸多态性的研究进展〔J〕.中国肺癌杂志，2011;14(2)：156-8.

3Lee SJ，Jeon HS，Jang JS，etal.DNMT3B polymorphisms and risk of primary lung cancer〔J〕.Carcinogenesis，2005;2(26)：403-9.

4林 昀，黄 健，韩泽广.表遗传学与肿瘤〔J〕.国际遗传学杂志，2006；29(3)：191-3.

5蒋逸群，胡多沙，段 芝，等.DNA甲基化、单核苷酸多态性与肿瘤〔J〕.国际病理科学与临床杂志，2011；31(6)：499-502.

6Shen H，Wang L，Spitzm R，etal.A novel polymorphism in human cytosine DNA2methyltransferase3B promoter is associated with an increased risk of lung cancer〔J〕.Cancer Res，2002；62(17)：4992-5.

7Lee SJ，Jeon HS，Jang JS，etal.DNMT3B polymorphisms and risk of p rimary lung cancer〔J〕.Carcinogenesis，2005；26(2)：403-9.

8Hu J，Fan H，Liu D，etal.DNMT3B promoter polymorphism and risk of gastric cancer〔J〕.Dig Dis Sci，2009；55(4)：1011-6.

9Srivastava K，Srivastava A，Mittal B.DNMT3B-579 G>T promoter polymorphism and risk of gallbladder carcinoma in North Indian population〔J〕.J Gastrointest Cancer，2010；41(4)：248-53.

10Wang H，Tan W，Hao B，etal.Substantial reduction in risk of lung adenocarcinoma associated with genetic polymorphism in CYP2A13，the most active cytochrome P450 for the metabolic activation of tobacco-specific carcinogen NNK〔J〕.Cancer Res，2003；63(22)：8057-61.

11Cauffiez C，Lo-Guidice JM，Quaranta S，etal.Genetic polymorphism of the human cytochrome CYP2A13 in a French population：implication in lung cancer susceptibility〔J〕.Biochem Biophys Res Commun，2004；317(2)：662-9.

12D′Agostino J，Zhang X，Wu H，etal.Characterization of CYP2A13*2，a variant cytochrome P450 allele previously found to be associated with decreased incidences of lung adenocarcinoma in smokers〔J〕.Drug Metab Dispos，2008；36(11)：2316-23.

13Zhang X，Miao X，Guo Y，etal.Genetic polymorphisms in cell cycle regulatory genes MDM2 and TP53 are associated with susceptibility to lung cancer〔J〕.Hum Mutat，2006;27(1)：110-7.

14Mechanic LE，Bowman ED，Welsh JA，etal.Common genetic variation in TP53 is associated with lung cancer risk and prognosis in African Americans and somatic mutations in lung tumors〔J〕.Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，2007;16(2)：214-22.

15Sauter W，Rosenberger A，Beckmann L，etal.Matrix metalloproteinase 1(MMP1)is associated with early-onset lung cancer〔J〕.Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，2008;17(5)：1127-35.

16张淑红，杨琳红，马雪梅，等.DNMT3B基因SNP(-149C/T)与佳木斯地区肺癌发病风险的关系〔J〕.中国老年学杂志，2011;31(21)：4090-1.

17杨永强，王巍杰，徐长波.单核苷酸多态性研究进展〔J〕.化学与生物工程，2009;26(8)：19-21.