肝癌细胞中SPARC表达及其与糖酵解作用的相关性

华红伟 姜 峰 胡薇薇 李 静 丁 罡

分泌性富含半胱氨酸的酸性蛋白(secreted protien acidic and rich in cysteine,SPARC)是细胞外基质非胶原糖蛋白中的1种钙结合蛋白，也称骨连接蛋白(osteonectin)[1]。SPARC基因定位于人类染色体5q31.3-q32[2]，编码由298-304个氨基酸组成的蛋白质。SPARC蛋白参与多种生物学过程，包括胚胎发育，成骨组织形成，伤口愈合及组织重建等[3]；同时，与肿瘤的发生发展也密切相关，主要涉及新生血管的形成[4]，调控细胞周期，调节细胞的粘附作用[5]等过程，但SPARC与肿瘤细胞糖酵解之间的调节关系及作用机制目前尚未见报道。

糖酵解作用中己糖激酶(hexokinase 2,HK)是第一个限速酶，当细胞中HK活力增强时，6-磷酸葡萄糖增加，为糖酵解提供充足的碳源和能源[6]；乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase-A,LDHA)是糖酵解途径的末端酶，催化丙酮酸转化为乳酸，LDHA在多种肿瘤中高表达，提示LDHA与肿瘤的发生发展有密切的关系。本研究以肝癌细胞HepG2、Hep3B、Huh7为研究对象，观察SPARC表达与HK-Ⅱ及LDHA活性之间的相互作用关系，初步探究SPARC与糖酵解作用之间的相互关系及作用机制。

1 材料与方法

1.1 细胞

本实验选取HepG2、Hep3B、Huh7人肝癌细胞作为研究对象，购自于美国菌种保藏中心细胞库(ATCC)。细胞株培养于含5%二氧化碳、温度为37.5 ℃、饱和湿度的培养箱中，所用DMEM培养液中加入10%胎牛血清及青-链霉素双抗(penicillin-streptomycin,PS)。

1.2 主要试剂及耗材

SPARC质粒及siRNA购自于北京傲锐东源生物科技有限公司；Oligofectamine、pti-MEM®I 低血清培养基购自于Invitrogene 公司；乳酸脱氢酶活性检测试剂盒购自于BioVision公司；己糖激酶比色检测试剂盒购自于Sigma公司。

1.3 实验方法

1.3.1 质粒/siRNA的转染 转染前一天取出对数生长期的细胞，以每孔3-5×105密度接种于6孔细胞培养板上，当细胞融合率在70%～80%时进行转染实验；……