Real time-PCR检测循环DNA基因对原发性肝癌的临床诊断价值

郭丽萍

原发性肝癌(prjmary hepatic cancer，PHC)是肝细胞或肝内胆管细胞发生癌变导致的肝癌，是消化系统最为常见的恶性肿瘤，主要包括肝细胞癌(hepatic cellular cancer，HCC)、肝内胆管细胞癌(intrahepatic bile duct cellular cancer，ICC)和肝细胞癌-肝内胆管细胞癌混合型等不同病理类型，其中90%患者为肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)[1]。目前血清AFP是诊断肝癌(HCC)的重要指标和特异性最强的肿瘤标记物，国内常用于肝癌的普查、早期诊断、术后监测和随访；在本研究中，我们采用real time-PCR方法，通过检测血浆循环DNA载量表达情况，探讨循环DNA的临床早期筛查价值，为循环DNA作为原发性肝癌早期筛查肿瘤标志物提供科学实验依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象

选取2008年6月至2013年6月于我院收治的肝病患者，根据《中国常见恶性肿瘤诊疗规范》第二分册原发性肝癌或《原发性肝癌诊疗规范(2011年版)》诊疗标准，经临床症状、影像学检查、肿瘤标志物及病理检查诊断为原发性肝癌后确定为研究对象[2-3]。经诊断符合本研究目的患者共63例，男性41例(65.1%)，女性22例(34.9%)，平均年龄为(58±19.6)岁，其中有淋巴结转移者36例(57.1%)。此外选取25例经体检健康的志愿者作为正常对照组，平均年龄为(56±18.6)岁。

1.2 血浆DNA提取

无菌采取研究对象患者组及对照组志愿者血液2～3 ml，分离血浆，根据天根DNA提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司)说明书提取血液基因组DNA，-20℃保存备用。

1.3 引物及荧光探针设计合成

根据已发表文献选取β-globin 基因(GenBank ID:U01317)作为目的基因分析循环DNA血液载量，引物为，β-globin-F：5’-GTG CAC CTG ACT CCT GAG GAG A-3’；β-globin-P：5’-CCT TGA TAC CAA CCT GCC CAG-3’；Taqman荧光探针：5’-(FAM)AAG GTG AAC GTG GAT GAA GTT GGT GG(TAMAAR)-3’。上述所有引物序列均由Invitrogen(北京)公司合成。

1.4 循环DNA real time-PCR载量检测

Real-Time PCR检测原发性肝癌患……