农杆菌介导LJAMP2基因导入‘红阳’猕猴桃及分子鉴定

周月1，赵许朋1，吴秀华1，张艳玲1，张林1，罗克明1,2，汤绍虎1,2



农杆菌介导基因导入‘红阳’猕猴桃及分子鉴定

周月，赵许朋，吴秀华，张艳玲，张林，罗克明，汤绍虎

1 西南大学三峡库区生态环境教育部重点实验室，重庆 400715 2 西南大学生命科学学院，重庆 400715

周月, 赵许朋, 吴秀华, 等. 农杆菌介导LJAMP2基因导入‘红阳’猕猴桃及分子鉴定. 生物工程学报, 2014, 30(6): 931−942.Zhou Y, Zhao XP, Wu XH, et al.Agrobacterium-mediated transformation of LJAMP2 gene into ‘Red Sun’ kiwifruit and its molecular identification. Chin J Biotech, 2014, 30(6): 931−942.

为了获得抗溃疡病的‘红阳’猕猴桃转基因植株，以红阳猕猴桃试管苗叶盘为转基因受体材料，通过根癌农杆菌介导将CaMV35S启动子调控下的基因导入红阳猕猴桃。450个叶盘与携带表达载体质粒pBI121的根癌农杆菌菌珠LBA4404共培养2 d后，转入含25 mg/L Kan的筛选培养基培养40 d，15 d 转接1次，之后30 d继代1次。结果表明，在MS+3.0 mg/L BA+1.0 mg/L NAA筛选培养基中，Kan芽率达85%以上，在1/2 MS+0.8 mg/L IBA培养基中，Kan芽生根率达100%。共获得Kan再生植株40株，经GUS组织染色和PCR分析证明，其中23株为转基因植株。阳性率为57.50%，转化率达5.11%。抗溃疡病基因已成功导入红阳猕猴桃，为红阳猕猴桃的抗病基因工程育种奠定了基础。

‘红阳’猕猴桃，溃疡病，基因，遗传转化，根癌农杆菌

猕猴桃营养极为丰富，被誉为“水果之王”。到2009年，中国猕猴桃栽培面积和产量均居世界第一，分别占全球份额的53%和38%。‘红阳’猕猴桃为我国特有红心品种，果肉翡翠绿色，横切面自果心向外具放射状血红色条纹，总糖含量达13.45%，高出世界流行品种‘海沃德’近5%，口感特好，堪称猕猴桃极品；2002年被列为世界第3代猕猴桃首选品种；2004年起受国家原产地产品保护。其栽培面积日益扩大，商品果产量连年增加，而目前产品数量和质量尚不能满足市场需求。

猕猴桃属典型呼吸跃变型果实，采后室温下只能贮藏一星期左右。货架期太短，贮藏和运输不便，采后成本增加；同时，猕猴桃病虫害每年都会给主产区造成巨大经济损失。近年来，猕猴桃溃疡病传播迅速，危害程度日趋严重。秦岭北麓主产区中华系品种溃疡病感病园达90%，感病株达60%以上，每年因此平均减产20%左右。单纯依靠常规育种和喷洒农药不能有效解决猕猴桃产业中的突出问题，迫切需要以红阳猕猴桃为基础培育出一个高抗病性且耐贮保鲜的猕猴桃新品种。

植物基因工程为猕猴桃种质改良开辟了新途径。猕猴桃的遗传转化始于上世纪90年代，转化方法普遍为农杆菌介导法，转化受体从开始以茎段、愈伤为主，发展到近年以叶盘为主。近年来，人们将大豆b-1,3-内切葡聚糖酶基因、番茄ACC合成酶和猕猴桃ACC氧化酶 (ACO，乙烯合成酶) 反义基因导入猕猴桃，提高了植株的抗病性，获得了转化苗和降低了ACO基因的表达量。近年，抗菌肽 (Antimicrobial peptides，AMPs) 在植物基因工程领域广受关注。2006年，Yang等从益母草种子中分离到一种新的非专一性脂转移类蛋白 (nsLTPs) 的抗菌肽，命名为LJAMP2。成熟的LJAMP2由91个氨基酸组成，表观分子量6.2 kDa，等电点为8.67。烟草、番茄分别转入nsLTPs基因 (、)和后，抗病性显著提高。Yang等克隆了LJAMP2基因，在烟草、毛白杨和油菜中表达，表现出广谱抗菌活性。然而，现有的猕猴桃基因工程报道，主要进行的是遗传转化体系的建立，实际转入目的基因的不多，除涉及花器官发育、激素代谢、耐盐和果实呼吸外，涉及抗病基因的太少，LJAMP2基因还未被利用。本试验在赵许朋等成功建立红阳猕猴桃叶盘高频直接再生体系基础上，采用根癌农杆菌介导法首次将导入红阳猕猴桃，并获得了转基因植株，为红阳猕猴桃的抗病基因工程育种奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料与感染受体

植物材料为‘红阳’猕猴桃 (cv. ‘Red Sun’) 试管苗，由本实验室保存；感染受体为源于幼嫩叶片的叶盘 (大小约0.5 cm×0.5 cm)。

1.1.2 质粒与菌株

转化所用质粒为pBI121，其表达载体：：含有报告基因、CaMV 35S启动子调控的目的基因和标记基因。质粒通过冻融法转入根癌农杆菌菌株LBA4404中。工程菌株LBA4404由西南大学生命科学学院罗克明教授提供。

1.2 方法

1.2.1 农杆菌的培养与活化

农杆菌 (工程菌株LBA4404) 的培养与活化参照高月等的方法进行。菌液离心后用含0.1 mmol/L乙酰丁香酮 (AS) 的液体MS培养基重悬浮，然后用于转化。

1.2.2 农杆菌侵染与共培养

无菌条件下，将叶盘接种到出芽培养基上预培养3 d；放入浓度为=0.5的菌液中，轻微振荡，侵染10 min；沥干，用无菌滤纸吸去多余菌液，平放在含0.1 mmol/L AS的出芽培养基上共培养2 d(暗培养，25 ℃±2 ℃)；取出，无菌水冲洗4次，接种到含25 mg/L卡那霉素+400 mg/L羧苄青霉素的出芽培养基上筛选Kan抗性芽 (Kan芽)。前40 d每15 d转接1次 (30 d暗+10 d光照培养)，之后每30 d继代一次 (光照培养)。不定芽长至高3 cm以上时，切下，先插入固体生根培养基中培养15 d，后转入充分吸附液体生根培养基的珍珠岩基质中培养15 d (光照培养)，得到Kan植株。洗净其根部基质，移栽到温室营养钵中。出芽培养基为MS+3.0 mg/L BA+1.0 mg/L NAA，不定芽继代为MS+2.0 mg/L BA+1.0 mg/L NAA+0.1 mg/L GA，生根培养基为1/2 MS+0.8 mg/L IBA；培养温度 (25±2) ℃，光照强度4 500 lx (16 h/d)。筛选有关转化因素的水平时，变化筛选因素水平，其他因素的水平依此不变。每处理接种8−10个叶盘，重复3−4次。

1.2.3 GUS组织染色与转基因植株的PCR检测

GUS基因瞬时表达的检测参照尚霄丽等的方法进行，检测材料为Kan丛芽或Kan植株的叶片。

红阳猕猴桃基因组DNA以叶片为材料采用改良CTAB法提取。转基因植株PCR检测以GUS阳性植株的基因组DNA为模板，通过扩增标记基因和目的基因进行筛选。根据Yang等的报道，分别设计特异引物。基因的上游引物序列为5'-AGGCTATTCGGCTATGACTGG-3'，下游引物序列为5'-TCGGGAGCGGCGATACCGTA-3'；基因的上游引物序列为5'-ATGGCTGCCTTGATCAAGTTG-3'，下游引物序列为5'-CAGTGCACCTTTGAGCAATC-3'。PCR反应条件：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35个循环；最后72 ℃延伸10 min。扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。

2 结果与分析

2.1 部分转化因素水平的确定

2.1.1 卡那霉素 (Kan) 选择压的确定

将叶盘直接接种在含不同浓度Kan的出芽培养基中培养4−6周。结果 (表1) 表明，在未添加Kan的培养基中，叶盘分化正常。培养6周后，出芽率达100%，每个叶盘平均出芽18个以上 (图1A)；随着培养基中Kan浓度的升高，叶片分化受到明显抑制。Kan=20 mg/L时，培养6周后叶片虽能脱分化和低频 (8.56%) 产生愈伤组织，但不能分化出不定芽；Kan≥25 mg/L时，愈伤组织和不定芽的形成完全被抑制，外植体逐渐褐化、死亡 (图1B)，说明红阳猕猴桃叶片在直接再生不定芽的过程中对Kan比较敏感。因此，在本试验中，用于叶盘转化的Kan选择压确定为25 mg/L。

2.1.2 羧苄青霉素 (Carb) 和头孢霉素 (Cef) 抑菌浓度的确定

叶盘经农杆菌侵染和共培养后，接种到含不同浓度Carb和Cef的出芽培养基中培养4周。结果 (表2) 表明，100−600 mg/L Cef不能抑制农杆菌的生长。100−500 mg/L Cef时，叶盘因污染全部死亡；600 mg/L Cef时，叶盘成活率仅2.14%。而100−500 mg/L Carb能不同程度地抑制农杆菌生长。随着Carb浓度的提高，叶盘成活率提高。200 mg/L Carb时 (图1C)，平均成活率较低 (8.93%)；400 mg/L和 500 mg/L Carb时，成活率达100%。但500 mg/L Carb明显影响不定芽再生，而400 mg/L Carb无明显影响 (图1D)。因此，本试验采用 400 mg/L Carb抑制共培养后筛选过程中农杆菌的生长。

2.1.3 叶盘预培养和农杆菌侵染时间对转化频率的影响

叶盘在农杆菌侵染前经不同时间的预培养，共培养前用农杆菌侵染不同时间，并在抗性筛选结束后，取Kan芽的叶片进行GUS染色。试验结果表明，预培养1−5 d后，转化率 (以瞬时表达率表示，后同) 均显著提高，分别比对照 (61.78%) 提高9.02%、25.07%、41.39%、36.16%和21.95% (图2A)。其中，预培养3 d的转化率最高 (87.35 %)，且与预培养1 d、2 d和5 d均存在显著差异 (≤0.05)，仅与4 d无显著差异 (＞0.05)。因此，本试验叶盘预培养的适宜时间为3 d。

农杆菌侵染0.5−30 min后，其转化率的变化趋势与叶盘预培养相同 (图2B)。其中，侵染10 min转化率最高 (57.20%)，比0.5、5、15和30 min分别提高140.34%、23.81%、33.64%和21.34倍，且与它们均存在显著差异。因此，本试验农杆菌侵染的最佳时间为10 min。

表1 Kan对叶片外植体愈伤组织和不定芽诱导的影响

Note: different letters a, b, c, d in a column mean significant difference in different samples (≤0.05). The same as table 2.

图1 抗生素对‘红阳’猕猴桃叶片不定芽分化的影响

表2 羧苄青霉素和头孢霉素对选择培养中外植体成活率的影响

图2 叶盘预培养(A) 和农杆菌侵染时间(B) 对转化频率的影响

2.1.4 乙酰丁香酮对转化频率的影响

叶盘被农杆菌侵染后在共培养期间，于共培养基中加入不同浓度的乙酰丁香酮 (AS)，取Kan芽的叶片进行GUS染色。结果表明，AS对转化频率有显著影响 (图3)。培养基中添加 0.1、0.2、0.3和0.5 mmol/L AS时，转化频率比对照 (58.67%) 分别提高25.16%、22.99%、15.66%和6.07%。其中，添加 0.1、0.2和0.3 mmol/L AS时，转化频率与对照均存在显著差异，而相互间无显著差异。因此，本试验确定在共培养基中添加0.1 mmol/L AS，以提高红阳猕猴桃叶盘的遗传转化频率。

图3 乙酰丁香酮对转化频率的影响

2.2 抗性植株叶片的GUS染色

本试验通过叶盘预培养、农杆菌侵染、共培养和筛选培养，共获得独立的Kan植株40株，移栽后生长正常 (图4A)。因植物表达载体：：含有报告基因，故首先对Kan植株的叶片进行GUS组织染色。结果表明，在被检测的40株Kan植株中，有23株呈蓝色 (图4B)，为GUS阳性再生植株；其余17株和未转化的植株没有显示出蓝色 (图4C)。初步表明外源目的基因已整合到红阳猕猴桃部分Kan植株的基因组中。

2.3 转基因植株的PCR检测

对23株GUS阳性再生植株，以其基因组DNA为模板，以：：质粒DNA (图5A) 为阳性对照，非转化植株的基因组DNA为阴性对照，利用特异性引物，分别对标记基因和目的进行PCR扩增。部分GUS阳性再生植株 (8株) 的扩增产物的电泳结果如图5B、图5C所示。在以GUS阳性植株的基因组DNA和载体质粒为模板，以基因特异引物进行扩增时，GUS阳性植株均获得1条与预期结果大小一致的片段 (749 bp)，而非转化 (野生型) 植株未扩增出特异条带 (图5B)；在对基因进行扩增时，GUS阳性植株皆得到1条与质粒作模板扩增条带大小相同的条带，而非转化植株基因组做模板也未获得扩增产物 (图5C)。其余15株GUS阳性再生植株的PCR扩增结果与此相同 (未列出) 。上述检测结果证明，外源目的基因已成功整合到红阳猕猴桃GUS阳性植株的基因组上。

图4 转基因‘红阳’猕猴桃的GUS组织化学染色

图5 转基因植株PCR检测NPTⅡ、LJAMP2基因结果

本试验共转化叶盘450个，出芽率在85%以上，Kan芽生根率达100%。共获得Kan植株40株，Kan植株获得率为8.89%；经GUS染色和PCR检测，40株Kan植株中23株呈阳性，阳性植株获得率为57.50%。整体转化频率达5.11%。

3 讨论

3.1 关于‘红阳’猕猴桃的遗传转化条件

农杆菌介导的遗传转化是农杆菌与植物组织共同作用的复杂过程，凡涉及到农杆菌活性和受体细胞生理状态的所有因素都可能影响到转化效果。

3.1.1 Kan选择压与叶盘预培养时间

在植物遗传转化中，需要根据筛选标记基因的性质，选择合适的抗生素来筛选抗性芽。而浓度过低，会产生假阳性抗性芽和大量嵌合体；浓度过高，会延缓抗性芽分化，甚至造成外植体褐化、死亡。

Kan能抑制细胞中核糖体蛋白质的合成，一定浓度时抑制细胞生长。在本试验中，适宜的Kan选择压为25 mg/L。这与郭卫东等的研究结果一致，而与Honda等(50 mg/L)和Han等(150 mg/L) 的不一致。主要原因是不同品种因基因型不同，耐Kan能力存在差异。

侵染前对外植体进行预培养，可以促进细胞分裂，因而更易整合外源DNA，从而提高转化率。在本试验中，叶盘预培养的适宜时间为3 d。这与郭卫东等的研究结果一致，而与Wang等 (4周)相差较大。主要原因可能是叶盘在侵染前生理差异太大。

3.1.2 农杆菌侵染与共培养时间

农杆菌侵染和共培养时间是整个遗传转化中最重要的2个因素，因为农杆菌的附着、T-DNA的转移和整合都在这个时期完成。时间太短，不能完成转化；时间太长，筛选时难以脱菌，甚至由于农杆菌的毒害和选择压力的存在造成外植体褐化、死亡。农杆菌侵染时间一般不超过30 min，共培养时间一般应长于16 h。

在本试验中，农杆菌侵染的最佳时间为10 min。这与郭卫东等的研究结果一致，而与宋喜贵等 (15 min)和苑平等 (30 min)不一致。

尚霄丽等认为，不同品种的猕猴桃共培养时间不同，大多数以2−4 d转化率较高。在已有报导中，共培养时间，有的为2 d，多数为3−4 d。在本试验中，我们根据高月等的研究报道并结合实际预试结果，将共培养时间确定为2 d。

3.1.3 转化过程中AS的作用

根癌农杆菌Ti质粒的Vir区对T-DNA的转移起介导作用，而植物受伤细胞分泌的某些酚类化合物 (AS等) 对根癌农杆菌Vir基因的表达有诱导作用。因此，在菌液或共培养基中添加一定浓度AS，通常可提高转化率。本试验在共培养基中添加0.1 mmol/L AS后，转化率提高。这与苑平等的研究结果一致，而与尚霄丽等 (0.2 mmol/L)不一致。这可能与不同品种叶盘的生理状态，尤其与自身AS含量有关 (本试验和部分此列文献中侵染菌液含AS)。

3.1.4 菌液浓度与抗生素抑菌浓度

菌液浓度对转化频率的影响同侵染与共培养时间相同。一般认为适宜的菌液浓度=0.5左右。在已有报导中，菌液浓度 (值) 有的为0.5，有的0.6，个别较低 (0.3)，个别很高 (1−1.5)。本试验根据高月等的报道，结合实际预试结果，把菌液浓度确定为=0.5。

抗生素抑菌浓度主要与农杆菌对所用抗生素的敏感性、菌液浓度和共培养时间有关。在本试验中，通过不同浓度Carb和Cef的比较试验，结果在Kn芽的筛选过程中，除菌效果Carb明显优于Cef，其最适浓度为400 mg/L。

显然，不同农杆菌菌株的侵染能力、转化时菌株的活化状态、植物受体的生理状态和对抗生素的耐受性都不尽相同，即使菌液浓度和侵染时间相同，同品种猕猴桃在不同试验中转化率也会存在差异。因此，在特定品种的遗传转化中，在确定所用菌株和抗生素后，只有努力造就菌株和受体良好的生理状态，同时采用适宜的菌液浓度、侵染与共培养时间以及抗生素浓度，才能获得较高的转化率。

目前，在猕猴桃遗传转化中，Kan芽得率一般在4%左右。本试验Kan芽得率虽然较高 (8.89%)，但与其叶盘直接再生频率 (100%) 相差甚远，而且整体转化频率 (5.11%) 也还不高。因此，本试验中的遗传转化条件还需优化，尤其是菌液浓度、共培养时间等因素的使用水平还应进一步筛选。

3.2 关于猕猴桃的溃疡病和基因工程育种

作物病害是农业生产中的突出问题，其损失占粮食总产量的10%−15%，而植物病原菌突变频率上升和抗药性增强是病害大发的根本原因。溃疡病是猕猴桃栽培中最具毁灭性的病害，由细菌类的丁香假单胞杆菌猕猴桃致病变种 (pv.) 引起，其适生范围广、发生迅猛、致病性强、难以根除，可在短期内造成大面积树体死亡。溃疡病现已在我国四川、陕西、安徽、湖南和福建等省的猕猴桃栽培区域发生，是猕猴桃生产面临的重大问题。

抗菌肽也称抗菌蛋白 (Antimicrobial proteins，AMPs)。在植物抗病基因工程中，AMPs显示出明显优势。AMPs广泛存在于动植物和微生物中，主要作用于细胞膜而实现广谱杀菌作用。近年来，人们将不同来源的抗菌肽导入植物，获得了一些抗病转基因植株。

本试验针对猕猴桃栽培中的突出问题，在国内外首次利用抗溃疡病的AMPs基因转化红阳猕猴桃，在国内率先开展猕猴桃抗病基因的遗传转化，并获得了经GUS组织染色和PCR鉴定的转基因植株，这将有助于红阳猕猴桃的基因工程研究，从而促进猕猴桃的产业发展。当然，本试验所获得的转基因植株还需通过Southern等分子杂交和RT-PCR等目的基因的表达分析以进一步验证其可靠性。构建双价或多价转化载体，同时将抗病、耐贮基因导入红阳猕猴桃，以期培育出既抗病又耐贮的猕猴桃新品种，应当是今后我国猕猴桃基因工程育种的主攻方向。

REFERENCES

[1] X Wang KQ, Zhou JF, Wang XB. Cultivation and management of Red Sun kiwifruit. Shanxi Forest Sci Technol, 2010, (5): 68–71 (in Chinese).汪克强, 周建峰, 王晓兵. 红阳猕猴桃的栽培与管理. 陕西林业科技, 2010, (5): 68–71.

[2] Gao XN, Zhao ZB, Huang QL, et al. Advances in research on bacterial canker of kiwifruit. J Fruit Sci, 2012, 29(2): 262–268 (in Chinese).高小宁, 赵志博, 黄其玲, 等. 猕猴桃细菌性溃疡病研究进展. 果树学报, 2012, 29(2): 262–268.

[3] Ning YY, Xiong QE, Zeng WG, et al. Studies on red flesh sport from‘Red Sun’kiwifruit using RAPD marker. Acta Hortic Sin, 2003, 30(5): 511–513 (in Chinese).宁允叶, 熊庆娥, 曾伟光, 等. 红阳猕猴桃全红芽变系的RAPD分析. 园艺学报, 2003, 30(5): 511–513.

[4] Zou J, Ren HX. The Empress of. Market Weekly, 2007, (27): 34–36 (in Chinese).邹谨, 任华兮. 中华猕猴桃皇后. 农产品市场周刊, 2007, (27): 34–36.

[5] Ding J, Liu SX, Song HH, et al. Growth and development patterns of Hongyang kiwifruits. Food Sci, 2010, 31(20): 473–476 (in Chinese).丁捷, 刘书香, 宋会会，等. 红阳猕猴桃果实生长发育规律. 食品科学, 2010, 31(20): 473–476.

[6] Wang MZ. Study on quality system of Hongyang kiwifruit——prevent diseasesand insect pests. Resour Dev Market, 2005, 21(5): 344–644 (in Chinese).王明忠. 红阳猕猴桃质量体系研究——病虫害及其防治. 资源开发与市场, 2005, 21(5): 344–644.

[7] Yuan P, Tian HX, Liu Y, et al. Establishment of a genetic transformation system of Hongyang kiwifruit. Life Sci Res, 2012, 16(5): 395–402 (in Chinese).苑平, 田宏现, 刘艺，等. 红阳猕猴桃遗传转化体系的建立. 生命科学研究, 2012, 16(5): 395–402.

[8] Zhao LN, Hu JY, Ye ZF, et al. Molecular identification and pathogenicity detection ofpv.. J Huazhong Agri Univ, 2012, 31(5): 604–608 (in Chinese).赵利娜, 胡家勇, 叶振风, 等. 猕猴桃溃疡病病原菌的分子鉴定和致病力测定. 华中农业大学学报, 2012, 31(5): 604–608.

[9] Liu ZD, Lü Y. Several problems in kiwifruit production. Northwest Horticulture (Fruits), 2011, (4): 5–6 (in Chinese).刘占德, 吕岩. 猕猴桃生产中存在的几个问题. 西北园艺 (果树), 2011, (4): 5–6.

[10] Gonzalez MV. Morphogenetic patterns in kiwi tissue culture and afterco-culture. Acta Hortic, 1990, 282: 358–364.

[11] Uematsu C, Murase M, Inhikawa H, et al.-mediated transformation and regeneration of kiwifruit. Plant Cell Rpt, 1991, 10(6/7): 286–290.

[12] Liu CL, Dong YY. Transformation of kiwi with. J Hunan Agri Col, 1994, 20(3): 214–221 (in Chinese).刘春林, 董延瑜. 美味猕猴桃遗传转化研究初报. 湖南农学院学报, 1994, 20(3): 214–221.

[13] Yazawa M, Suginuma C, Ichikkawa K, et al. Regeneration of transgenic plants from hairy root of kiwifruit induced by. Breeding Sci, 1995, 45(2): 241–244.

[14] Guo WD, Shen X, Li JR, et al.mediated transformation of kiwifruit with Lfy cDNA. Acta Hortic Sin, 1999, 26(2): 116–117 (in Chinese).郭卫东, 沈向, 李嘉瑞, 等. 利用Lfy cDNA转化猕猴桃的研究. 园艺学报, 1999, 26(2): 116–117.

[15] Han M, Gleave AP, Wang T. Efficient transformation ofby reducing the strength of basal salts in the medium to alleviate callus browning. Plant Biotechnol Rep, 2010, 4: 129–138.

[16] Honda C, Kusaba S, Nishijima T, et al. Transformation of kiwifruit using thegene alters tree architecture. Plant Cell Tiss Organ Cult, 2011, 107: 45–53.

[17] Wang TC, Ran YD, Atkinson RG, et al. Transformation of: a potential species for functional genomics studies in. Plant Cell Rep, 2006, 25: 425–431.

[18] Fan JF, Li JR, Han YF, et al. Studies on transformation of mtlD/gutD salt-resistant gene to kiwifruit (Qin mei). J Northwest Sci Tech Univ Agri For: Nat Sci Ed, 2002, 30(3): 53–58 (in Chinese).樊军锋, 李嘉瑞, 韩一凡, 等. MtlD/gutD双价耐盐基因转化秦美称猴桃的研究. 西北农林科技大学学报: 自然科学版, 2002, 30(3): 53–58.

[19] Shang XL, Feng JC, Zhu DH, et al. Establishment of efficient genetic transformation system ofby vacuum infiltration assisted method. Chin J Cell Bio, 2010, 2(1):126–130 (in Chinese).尚霄丽, 冯建灿, 朱道圩, 等. 真空辅助农杆菌介导中华称猴桃高效遗传转化体系的建立. 中国细胞生物学学报, 2010, 2(1): 126–130.

[20] Nakamura Y, Sawada H, Kobayashi S, et al. Expressing of soybean beta-1,3-endoglucanasa cDNA and effect on disease tolerance in kiwifruit plants. Plant Cell Reports, 1999, 18(7/8): 527–532.

[21] Tian HX, Yuan P, Wang ML, et al. Establishment of transformation system of kiwifruit Miliang-1. J Central South Univ Forestry Technol, 2012, 32(8): 81–85 (in Chinese).田宏现, 苑平, 王曼玲, 等. 米良一号猕猴桃遗传转化体系的建立. 中南林业科技大学学报, 2012, 32(8): 82–85.

[22] Tian HX, Yuan P, Wang ML, et al. Genetic transformation of kiwifruit with its ACC oxidase antisense gene. J Central South Univ Forestry Technol, 2012, 32(11): 115–121 (in Chinese).田宏现, 苑平, 王曼玲, 等. 猕猴桃ACC氧化酶反义基因转化猕猴桃的研究. 中南林业科技大学学报, 2012, 32(11): 115–121.

[23] Song XG, Yan MH, Lu ZS, et al. Primary study of expression of tomato’s anti-sense ACC synthase gene in transgenic. J Lianyungang Teach Col, 2003, (2): 69–71(in Chinese).宋喜贵, 阎茂华, 路正社, 等. 番茄ACC合成酶反义基因在转基因猕猴桃中表达的初步研究. 连云港师范高等专科学校学报, 2003, (2): 69–71.

[24] Yang XY, Li J, Pei Y, et al. Isolation and characterization of a novel thermostable non-specific lipid transfer protein-like antimicrobial protein from motherwort (Houtt) seeds. Peptides, 2006, 27(12): 3122–3128.

[25] Wang XW, Yang XY, Pei Y, et al. Analysis of disease resistance of nsLTPs-like antimicrobial protein gene transgenic tobacco against brown leafspot and granville blast. J Agric Biotechnol, 2006, 14(3): 365–370 (in Chinese).王晓雯, 杨星勇, 裴炎, 等. 转nsLTPs类抗菌蛋白基因烟草对赤星病和青枯病的抗病性分析. 农业生物技术学报, 2006, 14(3): 365–370.

[26] Li XB, Yang XY, Pei Y, et al. Enhancing disease resistance in transgenic tomato over-expressing antimicrobial proteins LjAMP1 and LjAMP2 from motherwort seeds. Acta Phytophyl Sin, 2007, 34(4): 353–358 (in Chinese).李先碧, 杨星勇, 裴炎, 等. 超量表达益母草种子抗菌蛋白提高番茄的抗病性. 植物保护学报, 2007, 34(4): 353–358.

[27] Yang XY, Wang XW, Pei Y, et al. Characterization and expression of an nsLTPs-like antimicrobial protein gene from motherwort (). Plant Cell Repots, 2008, 27(4):759–766.

[28] Jia ZC, Gou JQ, Luo KM, et al. Enhanced resistance to fungal pathogens in transgenicCarr. by overexpression of an nsLTP-like antimicrobial protein gene from motherwort (). Tree Physiol, 2010, 30: 1599–1605.

[29] Jiang YZ, Fu XL, Luo KM, et al. Overexpression of an nsLTPs-like antimicrobial protein gene () from motherwort () enhances resistance toin oilseed rape (). Physiol Mol Plant Pathol, 2013, 82: 81–87.

[30] Zhao XP, Luo KM, Tang SH, et al. Establishment of high frequency regeneration via leaf explants of ‘Red Sun’ kiwifruit (). Chin J Biotech, 2013, 29(11): 1599–1606 (in Chinese).赵许朋, 罗克明, 汤绍虎, 等. ‘红阳’猕猴桃叶盘高频直接再生体系的建立. 生物工程学报, 2013, 29(11): 1599–1606.

[31] Gao Y, Bi JH, Liu YL. Study on the optimum technological parmeters for genetic transformation of. J Fruit Sci, 2007, 24(4): 553–556 (in Chinese).高月, 毕静华, 刘永立. 阔叶猕猴桃遗传转化技术参数的优化. 果树学报, 2007, 24(4): 553–556.

[32] Xie XS, Dong JZ, Li J, et al. Research progress and prospect of plant diseases controlled by antimicrobial peptides. J Hebei Agri Sci, 2011, 15(2): 46–49 (in Chinese).谢咸升, 董建臻, 李静, 等. 抗菌肽控制植物病害研究进展及展望. 河北农业科学, 2011, 15(2): 46–49.

[33] Wang GL, Xia XY, Fang HJ, et al. Regeneration and antibacterial peptide gene transformation of cherry leaves. Acta Hortic Sin, 2003, 30(2): 209–211 (in Chinese).王关林, 夏秀英, 方宏筠, 等. 樱桃砧木叶片再生系统建立及抗菌肽基因转化. 园艺学报, 2003, 30(2): 209–211.

[34] Jia ZC, Sun YM, Luo KM, et al. Transformation of an antimicrobial peptide geneintoand resistance of the transgenic poplar to canker disease. Sci Silvae Sin, 2011, 47(7): 123–127 (in Chinese).贾之春, 孙一铭, 罗克明, 等. 转抗菌肽基因毛白杨的培育及其对溃疡病的抗性. 林业科学, 2011, 47(7): 123–127.

(本文责编 陈宏宇)

-mediated transformation ofgene into ‘Red Sun’ kiwifruit and its molecular identification

Yue Zhou, Xupeng Zhao, Xiuhua Wu, Yanling Zhang, Lin Zhang, Keming Luo, and Shaohu Tang

1 Key Laboratory of Eco-environments in Three Gorges Reservoir Region, Ministry of Education, Southwest University, Chongqing 400715, China 2 School of Life Science, Southwest University, Chongqing 400715, China

Bacterial canker caused bypv.is one of the most important diseases of kiwifruit () and leads to considerable yield losses. In order to obtain transgenic plants with resistance for ‘Red Sun’ kiwifruit to canker disease, a non-specific lipid transfer protein-like antimicrobial protein gene () from motherwort () was introduced into ‘Red Sun’kiwifruit through-mediated transformation. After two days of co-cultivation withstrain LBA4404 harboring:the transformed explants were transferred to the selection medium containing 25 mg/Lkanamycin+3.0 mg/L BA+1.0 mg/L NAA. The regeneration efficiency of kanamycin-resistant shoots reached to 85%. All (100%) of kanamycin-resistant shoots rooted on half-strength MS medium supplemented with 0.8 mg/L IBA and a total of 40 regenerated plantlets were obtained. PCR and histochemical GUS activity analysis show that 23 of 40 lines (57.50%) were positive, suggesting that thegene was integrated into the genome of ‘Red Sun’kiwifruit. Taken together, we established an efficient genetic transformation method for ‘Red Sun’ kiwifruit usings and the transformation frequency reached 5.11%. This protocol will be useful for the genetic breeding of ‘Red Sun’ kiwifruit for improvement of disease resistance.

‘Red Sun’kiwifruit (), canker disease,gene, genetic transformation,

September 13, 2013; Accepted:December 6, 2013

National Natural Science Foundation of China (No. 30871576).

Shaohu Tang. Tel:+86-23-68252838; E-mail: tangsh@swu.edu.cn

国家自然科学基金(No. 30871576) 资助。

网络出版时间：2014-02-12

http://www.cnki.net/kcms/doi/10.13345/j.cjb.130479.html