白杨素对人肝癌HepG2细胞的诱导分化作用

文红波，曹运长，虞佳，王五洲

（南华大学 药学与生物科学学院，湖南 衡阳 421001）

白杨素对人肝癌HepG2细胞的诱导分化作用

文红波，曹运长Δ，虞佳，王五洲

（南华大学 药学与生物科学学院，湖南 衡阳 421001）

目的探讨白杨素对人肝癌HepG2细胞的诱导分化和凋亡作用。方法体外培养人肝癌HepG2细胞，用白杨素干预细胞，实验分组为：空白对照组，溶媒组，全反式维甲酸阳性对照组，白杨素组。台盼蓝计数法和MTT法检测药物对细胞增殖活力的影响；瑞氏-姬姆萨和考马斯亮蓝染色观察细胞核质比和微管微丝排列的变化；放射免疫法检测细胞甲胎蛋白（Alpha-fetoprotein，AFP）的分泌量；酶促反应试剂盒检测细胞中γ-谷胺酰转肽酶（γ-glutamyltranspeptidase，γ-GT）和碱性磷酸酶（alkaline phosephatase，ALP）的活性；Diamondstone分光光度法测定细胞中酪氨酸α-酮戊二酸转氨酶（tyrosine-α-ketoglutaric acid transaminase，TAT）的合成情况。结果1～100 μmol/L白杨素和全反式维甲酸处理HepG2细胞48 h后，能显著抑制肝癌细胞的增殖（P＜0．05，P＜0．01），2种药物对细胞增殖的抑制效价相当并存在量效关系。10 μmol/L药物作用48 h，细胞的形态和微管微丝排列由肿瘤细胞向成熟细胞分化；药物处理24～96 h后，细胞AFP的分泌量和γ-GT的活性明显降低，ALP和TAT的活性则显著升高（P＜0．05，P＜0．01）。结论白杨素具有抑制人肝癌HepG2细胞增殖并诱导其向正常细胞分化的作用。

白杨素；HepG2细胞；细胞分化；黄酮类化合物

1 材料与方法

1.1 药品与试剂 人肝癌HepG2细胞株购自中国典型培养物中心（中国武汉）、全反式维甲酸（RA）、白杨素（ChR）为Sigma公司产品；RPMI-1640培养基为Gibco公司产品；胎牛血清为杭州四季青公司产品；甲胎蛋白（Alphafetoprotein， AFP）检测试剂盒购自原子高科股份有限公司；碱性磷酸酶（alkaline phosephatase，ALP）和γ-谷胺酰转肽酶（γ-glutamyltranspeptidase，γ-GT）检测试剂盒购自南京建成生物工程公司；台盼蓝试剂购自Sigma公司；L-酪氨酸、EDTA、DTT、磷酸吡多醛、α-酮戊二酸，对羟基甲醛、Triton X-100均购自上海生工生物工程有限公司。

1.2 仪器 DXC 800型全自动生化检测仪（德国Beckman Coulter公司），SN-697型γ放射免疫计数器（上海核所日环光电仪器有限公司），2406-2型CO2培养箱（美国Shel-lab公司），IX 51-A 12 PH型倒置显微镜（日本OLYMPUS公司），5840 R高速冷冻离心机（德国Eppendorf公司），天寒TH-86-500-LA型超低温冰箱（北京天地精仪科技有限公司），SP-752(SP-2000 UV)型紫外可见分光光度计（上海光谱仪器有限公司），ElX-800型酶联免疫检测仪（美国Bio-Tek公司）。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养 用含10%热灭活胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的RPMI-1640培养基，置37℃、5%CO2培养箱中培养HepG2细胞，2～3 d传代1次，取对数生长期细胞用于实验。

1.3.2 MTT比色法 取对数生长期细胞每孔1×104个细胞/180 μL接种于96孔培养板中，分别加入20 μL/孔的ChR和RA，使其终浓度分别为1.0、10、100 μM，设立完全培养基空白对照组和溶媒对照组（加入相同体积0.02%终浓度DMSO的完全培养基），每组设3个复孔，培养48 h。每孔加入5 g/L的MTT液20 μL，置培养箱中继续培养4 h后，1000 r/min离心10 min，弃上清，每孔加入DMSO 100 μL，震荡10 min以充分溶解紫蓝色沉淀物；用ElX-800型酶标仪以570 nm波长测定吸光度值（A值）。用公式计算细胞增殖相对抑制率：IR（%）＝（1－实验组A均值÷对照组A均值）×100%。以上实验重复3次。

1.3.3 细胞计数 取对数生长期细胞以1 mL/孔（2.0×104个/mL）接种于6孔培养板中，分别加入终浓度为1、10、100 μM的ChR和RA，设立完全培养基空白对照组和溶媒对照组。每组设3个复孔，孵育48 h后，台盼蓝染色后分别计活细胞数和死细胞数。按公式计算细胞存活率：CSR=处理组活细胞均数/空白对照组活细胞数×100%。实验重复3次。

1.3.4 细胞及微管微丝形态观察 采用细胞爬片技术，取对数生长期HepG2细胞接种于含灭菌盖玻片的6孔培养板中，每孔2×104个，待4 h细胞贴壁后，分别加入终浓度为10 μmol/L的ChR和RA，设立空白对照组和溶媒对照组，每组设3个平行孔。培养48 h后取出盖玻片，瑞氏-吉姆萨染色后观察细胞形态，考马斯亮蓝染色后观察细胞微管微丝排列的变化。

1.3.5 细胞样品的制备 取对数生长期的细胞2×104个/mL接种于50 mL培养瓶，每瓶1 mL，分别加入终浓度为10 μmol/L的ChR和RA，同时设立空白对照组和溶媒对照组，每组设3个平行瓶。药物分别处理24、48、72、96 h。分别收集细胞和细胞培养液。细胞裂解液超声破碎裂解细胞，离心取上清于－80℃保存。

1.3.6 生化检测 放免法测定细胞培养液中的AFP含量；自动生化仪检测细胞裂解液中γ-GTA和ALP的活性；Diamondstone分光光度法测定细胞裂解液中TAT的含量（速率法）。

2 结果

2.1 MTT法检测ChR对HepG2细胞增殖活性的影响1 μM、10 μM、100 μM的ChR和RA处理48 h后，与溶媒对照组相比，ChR和RA均能显著降低HepG2细胞的增殖活性，并呈浓度依赖性(见表1)。ChR的作用效价强度与诱导剂RA相当。

表1 ChR对HepG2细胞增殖活性的影响Tab.1 The effect of ChR on proliferation activity of HepG 2 cells

2.2 细胞计数法检测ChR对HepG2细胞生长的影响ChR（1 μM，10 μM 和 100 μM）作用 48 h，HepG2 细胞存活率显著降低，并呈浓度依赖性（见表2）。ChR降低HepG2细胞存活率的作用效价强度与诱导剂RA相当。

表2 ChR对HepG2细胞生长的影响Tab.2 The effect of ChR on cell viability of HepG 2 cells

2.3 ChR对人肝癌HepG2细胞形态变化的影响 为了观察ChR对人肝癌HepG2细胞的诱导作用，用10 μM ChR处理HepG2细胞48 h后姬姆萨染色显微镜观察细胞形态的变化。结果显示：显微镜下细胞形态由原来的卵圆形、多边形，贴壁叠堆状生长转变为长梭形或者条形，细胞叠堆状减少，细胞相互分散。药物处理后，细胞的细胞核变小，核仁的数目变少，由多个变为1个或者2个。而空白对照组和溶媒组的人肝癌HepG2细胞核大而且圆，细胞多且叠堆，核仁明显，数目多，细胞质较少(见图1)。结果表明：经药物处理后，人肝癌HepG2细胞异形性降低，趋向成熟分化。

图1 ChR处理HepG2细胞48 h后瑞氏-基姆萨染色细胞形态变化图（×100）Fig.1 Cell morphological variation of HepG 2 cells treated with ChR for 48 h(×100)

2.4 ChR对人肝癌HepG2细胞微管微丝变化的影响 为了进一步证实ChR对人肝癌HepG2细胞的诱导分化作用，采用考马斯亮兰染色显微镜观察10 μM ChR处理HepG2细胞48 h后微管微丝排列的变化。结果显示：细胞中微管微丝的数目显著增多，排列也变得更加整齐，微管微丝表面出现一些突起，呈正常成熟细胞的一些微管微丝所具有的形态。而对照组和溶媒组的细胞微管微丝的数目少，排列也非常不规则（见图2）。

图2 考马斯亮兰染色显微镜观察ChR对HepG2细胞微管微丝形态变化的影响（×100）Fig.2 Tubulin arrangement variation of HepG 2 cells treated with ChR for 48 h(×100)

2.5 ChR对HepG2人肝癌细胞特异性酶和蛋白的影响10μM的ChR孵育HepG2细胞24、48、72、96 h后，药物处理组和对照组的AFP分泌量和γ-GT含量以24 h为最高，而后随孵育时间的增加而逐渐降低，每个时相点ChR处理组的AFP分泌量和γ-GT含量明显低于溶媒组（P＜0.01），且呈时间依赖性（见图3A、3C），说明ChR能有效下调HepG2细胞AFP的分泌和抑制γ-GT的合成。与此同时，药物干预细胞后每个时相点ChR处理组的ALP和TAT酶活性显著高于溶媒组（P＜0.05，P＜0.01），并随处理时间的增加而增强（见图3B、3D），提示ChR能有效地上调HepG2细胞中ALP和TAT活性。

图3 ChR对HepG2人肝癌细胞特异性酶和蛋白表达的影响A. 对AFP分泌量的影响；B. 对ALP酶活性的影响；C. 对γ-GT酶活性的影响；D. 对TAT酶活性的影响*P＜0.05，**P＜0.01，ChR 组与溶媒对照组比较Fig.3 The effect of ChR on the expression of specific enzymes and proteins in HepG 2 human primary hepatocacinoma cellsA. AFP secretion；B. ALP activity；C. γ-GT activity；D. TAT activity*P＜0.05，**P＜0.01，compared with vehicle control

3 讨论

大量研究已证明，黄酮类化合物对肿瘤细胞的生长与增殖具有抑制作用，如Ko等研究发现木樨草素能诱导人白血病HL-60细胞凋亡及抑制HL-60细胞增殖[11]。白杨素为天然的黄酮类化合物，已有研究证实其对多种肿瘤细胞具有抑制效应。本研究发现白杨素能够明显地抑制人肝癌HepG2细胞的生长与增殖，并诱导其分化逆转，使人肝癌HepG2细胞增殖速度下降。

形态学上的分化是恶性肿瘤分化的标志。一般来说，肿瘤细胞的恶性程度越高，细胞的细胞核就越大，且核仁的数目也较多。肿瘤细胞内的细胞器也简单，数目少，微管微丝的数目也远低于正常的细胞。在本研究发现，人肝癌HepG2细胞经白杨素诱导后，细胞形态由原来的卵圆形、多边形，贴壁叠堆状生长转变为长梭形多者条形，细胞叠堆状减少，细胞相互分散，细胞的细胞核变小，核仁的数目也变少，由多个变为一个或者两个。同时观察到经诱导后的细胞中微管微丝的数目显著增多，排列也变得更整齐，微管微丝表面出现一些突起，呈现成熟细胞中微管微丝所具有的形态。这些结果提示，在白杨素的诱导下，人肝癌HepG2细胞已经在形态上向正常细胞分化了。

为探讨人肝癌HepG2细胞分化的定量指标，本研究根据肝细胞的代谢特点，选取了4种反映肝癌细胞是否分化的特异性酶或蛋白。γ-GT和TAT均为肝癌的标志酶，γ-GT与肝癌的分化程度呈负相关，后者则成正相关[12]。AFP在肝癌细胞中通常会高表达，而在正常细胞中不表达或低表达，是肝癌的重要标志物[13]。此外，Giani等[14]证明ALP是急性瘤细胞分化的标志，全反式维甲酸能显著升高肝癌细胞BEL-7402细胞中ALP的活力，表明ALP同样可作为肝癌细胞分化的标志物[15]。本研究结果表明，10 μmol/L的白杨素同全反式维甲酸一样，可有效地降低HepG2细胞中γ-GT的活性和下调AFP的表达，明显提高ALP的含量和TAT活性，且呈明显的时效关系，这与许多分化诱导剂对人肝癌细胞相关酶与蛋白的影响一致。综合以上结果，证实了白杨素可以抑制人肝癌HepG2细胞的生长与增殖，并能诱导其向成熟细胞分化，为将其开发为治疗人肝癌的诱导分化药物提供了理论资料。

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Differentiation of HepG 2 cell induced by chrysin

WEN Hong-bo, CAO Yun-changΔ, YU Jia, WANG Wu-zhou

（Department of Biochemistry and Molecular Biology, School of Pharmacy and Life Science, University of South China,Hengyang 421001, China）

ObjectiveTo investigate the effects of chrysin(ChR) on the induction of differentiation and apoptosis-promoting of HepG 2 human primary hepatocacinoma cells.MethodsThe HepG 2 cells were cultured in vitro and divided to four groups, control group, vehicle group, RA (alltrans retinotic acid) group and ChR group (10 μM), Gimsa staining and Coomassie brilliant blue staining were applied to observe the alterations of nucleocytoplasm and tubulin arrangement in HepG2 cells. The alterations of nucleocytoplasm and tubulin arrangement after Gimsa staining and Coomassie brilliant blue staining were observed. The survival rate and the inhibitory rates of HepG 2 cells were determine by trypan blue counting method and MTT assay. The Alpha-fetoprotein(AFP) secretory amounts of the cells were detected by radioimmunoassay(RIA). The activities of alkaline phosphatase(ALP) and γ-glutamyltranspeptidase(γ-GT) were assayed by enzymatic reaction kit. The synthesis of tyrosine-α-ketoglutaric acid transaminase(TAT) in cells were investigated by Diamondstone spectrophotometry.ResultsAfter treatment with ChR or RA at 1.0～100 μmol/L for 48 h, the proliferation of HepG 2 cells were inhibited significantly, compared with vehicle group (P＜0.05 or P＜0.01), the inhibitory potency of both ChR and RA on HepG 2 cells was equivalent and indicated in dose-dependent manner. After treatment with 10 μmol/L ChR or RA for 48 h, HepG 2 cells disaggregated and grew to spindle-shape, their nuclei became smaller and the number of nucleolus were fewer. Furthermore, tubulin arrangement of cells tended to be more ordered and the tubulin synthesis increased significantly. At 24～96 hours treated with 10 μmol/L ChR, the activities of TAT and ALP in cells were all increased distinctly (P＜0.05, P＜0.01), and the secretory amounts of AFP and the specific activities of γ-GT were decreased significantly (P＜0.05, P＜0.01).ConclusionChrysin can inhibit the proliferation of HepG 2 cells and induce them to differentiate to mature cells.

chrysin; HepG2 cells; cell differentiation; flavonoid compounds

R 735．7

A

1005-1678(2014)02-0033-04

目前，恶性肿瘤的诱导分化治疗已成为肿瘤生物学和肿瘤治疗学的研究热点和前沿领域，从天然产物、合成化合物及基因治疗药物中寻找新的肿瘤细胞抑制剂和分化诱导剂正不断取得进展。在众多的分化诱导剂中，黄酮类化合物是迄今发现的效果较好的一类化合物，黄酮类化合物是指一类从自然界各种植物中提取的呈黄色、不溶于水、无特殊气味等性质的化合物[1]。白杨素是从紫葳科植物木蝴蝶中提取的一类具有广泛药理作用的黄酮类化合物，化学名为5，7-二羟黄酮。已有研究表明，白杨素及其衍生物能显著抑制人卵巢癌A2780细胞[2]，人肺癌A549细胞[3]，人胃癌SGC-7901细胞[4]，人鼻咽癌CNE-2细胞[5]，人结肠癌HT-29细胞[6]等肿瘤细胞的生长并诱导其凋亡，且呈现剂量和时间依赖性；经过硝化作用后的白杨素能够抑制小鼠Lewis肺癌皮下移植瘤和肺转移瘤结节[7]；白杨素和它的四乙基二磷酸酯对Hela细胞也具有增殖抑制和诱导凋亡的作用[8]。白杨素还能抑制小鼠乳腺癌4T1细胞的转移性进展[9]；Pichichero等[10]证实白杨素能抑制人黑色瘤A375细胞的增殖，还能诱导其分化。以上研究多集中在白杨素对多种肿瘤细胞的增殖抑制和促凋亡作用上，而对肿瘤细胞的诱导分化作用研究不多。白杨素对人肝癌HepG2细胞是否具有生长抑制作用，并能否诱导其分化为成熟细胞，目前报道较少。本研究探讨了白杨素是否能用来作为人肝癌HepG2细胞的生长抑制剂和分化诱导剂，为人肝癌治疗寻找高效、低毒的活性化学分子即先导物提供实验和理论依据。

湖南省自然科学基金（06 JJ 30016）；衡阳市科技局项目（2009 KJ 09）

文红波，女，硕士，实验师，研究方向：肿瘤药理学研究，E-mail:wenhongbo-1437@tom.com；曹运长，通信作者，男，博士，副教授，研究方向：动脉粥样硬化分子机制研究，E-mail:caoychang@163.com。