链霉菌NG-715的抗真菌活性及稳定性研究

袁敏，卞华，李晶，张雪鹏，程琳

（南阳理工学院 医学实验中心，河南 南阳 473004）

链霉菌NG-715的抗真菌活性及稳定性研究

袁敏，卞华，李晶，张雪鹏，程琳

（南阳理工学院 医学实验中心，河南 南阳 473004）

目的研究链霉菌NG-715的抗真菌活性及稳定性，建立其生物活性的检测方法。方法以链霉菌NG-715所产抗真菌组分为材料，测试其对啤酒酵母、桔青霉、黑曲霉、黑根霉的最低抑制浓度和最低杀灭浓度。以黑曲霉为指示菌，测其生物检测法和稳定性。结果链霉菌NG-715所产抗真菌组分对啤酒酵母、桔青霉、黑曲霉、黑根霉的最低抑制浓度和最低杀灭浓度分别为 1．25、2．5、3．75、3．75 μg/mL和 2．5、10、17．5、17．5 μg/mL。生物检测法求得抑菌圈直径（mm）-浓度（μg/mL）的对数值之间的线性回归方程为y=26．963 x-27．6，R2=0．9991。该抗真菌组分耐热和酸碱，对紫外线较敏感。结论本研究为下一步对该抗真菌活性成分的分离提取提供了有益的试验数据。

链霉菌；抗真菌组分；最低抑制浓度；最低杀灭浓度；稳定性

随着抗药性问题的日益严重，从环境中筛选新的抗生素仍是一个有效的方法，特别是在生防和医药上。链霉菌产抗菌物质的研究国内外已有许多报道[1-6]，链霉菌NG-715菌株是2008年7月15日从南阳理工学院东南校区张仲景国医学院药用植物园所采集的120份土样中筛选得到的，前期研究结果显示其发酵液能强效抑制多种革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌及真菌，有望开发成新型高效广谱杀菌剂。为进一步评价该菌株的抗真菌应用潜力，笔者对其抗真菌活性和稳定性进行了研究。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品 经HPLC制备分析后纯度达到90%的抗真菌组分。

1.1.2 抑菌测定指示菌 啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、桔青霉（Penicillium citrinum）、黑曲霉（Aspergillus niger）、黑根霉（Rhizopus sp.）以上菌种均由本校生物与化学工程学院提供。

1.1.3 培养基 指示菌斜面、平板培养基为马铃薯葡萄糖培养基[7]。

1.1.4 主要仪器 高压蒸汽灭菌锅（宁波开普YXQ-50 LS），无菌操作工作台（苏州华宏BCM-1000），全自动旋转式摇床（上海天呈TS-100 B），生化恒温培养箱（苏州华宏SPX-250 F），电子天平（北京赛多利斯ALC-2100.2），722分光光度计（日本岛津UV-2201）。

1.2 方法

1.2.1 指示菌菌悬液的制备[8]将供试的各指示菌斜面用无菌水洗下菌苔，倒入带玻璃珠的30 mL无菌水三角瓶中，震荡20 min后，用722分光光度计检测650 nm波长处透光率，为20%时即成菌悬液。

1.2.2 生物活性的测定

①最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）的测定[9]不同浓度抗生素药液的配制：称取抗真菌组分样品4 mg，溶于6 mL无水乙醇，定容于50 mL容量瓶中，配制成80 μg/mL的溶液再将其稀释至70 μg/mL、60 μg/mL、50 μg/mL、40 μg/mL、30 μg/mL、20 μg/mL、10 μg/mL、5 μg/mL。将装有1.5 mL液体培养基的系列试管高压灭菌后，分别加入所稀释的不同浓度的抗真菌组分溶液0.5 mL，然后分别取啤酒酵母、黑曲霉、黑根霉、桔青霉的菌悬液0.1 mL，于上述每列不同试管中加入1种真菌菌悬液，震荡试管，使抗生素、菌悬液和培养基充分混匀。每种抗菌物质留一列放冰箱中做为对照管，其余置30℃培养箱内培养72 h检查结果。观察含抗生素对照管与真菌对照管的情况，然后再观察各试管中真菌生长情况，与抗生素稀释液对照管比较。如加入真菌的试管仍为澄清，即表示无菌生长，则该管有抗菌作用；如为浑浊，即表示真菌已生长，无抗菌作用，以完全无菌生长的最低抗生素浓度为抗真菌组分的MIC。

②最低杀菌浓度（minimum bactericidal concentration，MBC）的测定 与MIC测定相似，最低杀菌浓度（MBC）测定，也按上述试管稀释，分装于试管中，经接种（啤酒酵母、黑曲霉、黑根霉、桔青霉）菌液后，置30℃培养箱内培养72 h。观察抗真菌组分的最低抑菌浓度以上，未见真菌生长的各试验管培养物，分别吸取0.1 mL，移种至不含抗真菌组分的平皿琼脂培养基上，用刮铲涂匀，置30℃培养箱内培养72 h，观察有无真菌生长。平皿培养基中的真菌计数少于5个菌落者为抗真菌组分的MBC。

③抗真菌组分标准曲线的制作[7]将80 μg/mL的抗真菌组分溶液分别稀释至 70 μg/mL、60 μg/mL、50 μg/mL、40 μg/mL的溶液，在9 cm马铃薯葡萄糖琼脂双层平板上放置的牛津杯中滴加抗真菌组分的溶液，以黑曲霉为指示菌，进行生物测定试验。测定抑菌圈，以抑菌圈直径作纵坐标，抗真菌组分溶液浓度的对数为横坐标作图。

1.2.3 稳定性试验

①温度稳定性试验 将抗真菌组分溶液用无菌水稀释后，分别在 30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃水浴30 min。待自然冷却后，用管碟法[6]测其生物活性。重复3次。

管碟法操作如下：取灭过菌的平皿，在皿底做好标记。然后用大口移液管加入融化了的马铃薯葡萄糖琼脂培养基10 mL，放置水平台上使之凝固作为底层。熔化马铃薯葡萄糖琼脂培养基，待冷却至约50℃左右，以5%接种量接入黑曲霉菌悬液，旋转摇匀后，用另一大口移液管吸取10 mL，使其摊布均匀作为上层。待其凝固后，用镊子夹取无菌牛津杯，按预先标记的位置放于上层培养基上，滴加样品后，放置在30℃培养36 h后取出，用游标卡尺量取抑菌圈直径并记录。

②pH稳定性试验 取11份抗真菌组分溶液，每份1.5 mL，用不同的pH试液6.0 mL，将其调成pH 2～pH 12，然后将每份调好的样品分装成3支试管，这样就得到了3组pH值为2-12的样品。之后进行如下处理：第一组样品：25℃放置；第二组样品：30℃水浴30 min；第三组样品：30℃水浴60 min。将实验液用无菌水稀释5倍作为CK，用管碟法测其生物活性。重复3次。

③紫外线稳定性试验 将抗真菌组分溶液用无菌水稀释5倍后放入灭过菌的平皿中，敞口放置在紫外线下分别照射0 min、1 min、2 min、3 min、4 min、5 min、6 min、7 min、8 min、9 min、10 min、15 min、20 min、25 min、30 min、35 min 处理后，用管碟法测其生物活性。重复3次。

1.3 统计学方法 活性比率=样品平均抑菌圈直径/对照平均抑菌圈直径×100%。

2 结果

2.1 生物活性的测定

2.1.1 最低抑菌浓度和最低杀菌浓度的测定结果 抗真菌组分对4种真菌的最低抑菌浓度和最低杀菌浓度的测定结果见表1。

表1 抗真菌组分对几种真菌的最低抑菌浓度和最低杀菌浓度（μg/mL）Tab.1 Analysis of MICs and MBCs of the antifungal substance against 4 fungi(μg/mL)

2.1.2 抗真菌组分的标准曲线的制作 抗真菌组分样品生物检测结果见表2。根据表2的结果，以抑菌圈直径为纵坐标，抗真菌样品浓度的对数值作横坐标，作标准曲线，得线性回归方程y=26.963 x-27.6，R2=0.9991，说明生物活性测定法在抗真菌组分的质量浓度为40 μg/mL～80 μg/mL范围具有良好的线性。因此，可以采用该方法进行抗真菌物质含量的计算。

表2 抗真菌组分生物检测结果Tab.2 The bioassay results of the antifungal substance

2.2 稳定性的测定结果

2.2.1 温度稳定性试验结果 抗真菌组分的温度稳定性实验结果见表3。从表3可以看出：抗真菌组分在30℃～100℃各种温度水浴30 min条件下，与对照相比，其抑制黑曲霉的活性变化不大。这说明抗真菌组分对温度稳定，为以后进一步分离提取提供了相关条件。

表3 抗真菌组分的温度稳定性实验结果Tab.3 The stability of the antifungal substance at different temperaturs

2.2.2 pH稳定性试验结果 抗真菌组分的pH稳定性实验结果见表4。从表4可以看出：抗真菌组分溶液分别加入pH 2～pH 12的缓冲液，30℃水浴0min、30 min和60 min条件下，与对照相比，其抑制黑曲霉的活性变化不大，说明该组分耐酸碱。

2.2.3 紫外线稳定性试验结果 抗真菌组分的UV稳定性实验结果见表5。从表5可以看出：抗真菌组分在紫外线照射下不稳定。紫外线照射10 min后其抑菌活性为未照射时的88%；照射15 min后其抑菌活性大幅度下降为未照射时的64%；当照射时间超过30 min时，其抑菌活性全部消失，极有可能已经转化成了别的物质。

表4 抗真菌组分的pH稳定性实验结果Tab.4 The Stability of the antifungal substance at different pH and Time

表5 抗真菌组分的UV稳定性实验结果Tab.5 The Stability of the antifungal substance at different pH and Time

3 讨论

放线菌所产生的生物活性物质具有抗细菌、真菌、病毒、寄生虫和肿瘤等多种功能[10-13]。本研究以链霉菌NG-715所产生的抗真菌活性物质为对象，测试其对啤酒酵母、桔青霉、黑曲霉、黑根霉的最低抑制浓度和最低杀灭浓度分别为1.25、2.5、3.75、3.75 μg/mL 和 2.5、10、17.5、17.5 μg/mL。周云等[14]对农抗702抗真菌活性的测定结果中显示农抗702对啤酒酵母、桔青霉、黑曲霉、黑根霉的最低抑制浓度分别为6.5、6.5、3.3、3.3 μg/mL，在对啤酒酵母和桔青霉的抑制效果上，NG-715优于农抗702。赵华等[15]研究那他霉素的抑菌效果显示其对啤酒酵母、桔青霉、黑曲霉、黑根霉的最低抑制浓度分别为2.75、2.75、5.5、5.5 μg/mL，在对啤酒酵母和桔青霉的抑制效果上，NG-715优于那他霉素。

微生物发酵液中的有效化学成分的性质一般是未知的，且量较少，因而分离提取过程中，常采用生物活性试验来跟踪[16]。微生物检测法求得线性回归方程为y=26.963 x-27.6，R2=0.9991，说明生物活性测定法在链霉菌所产抗真菌物质的质量浓度为40 μg/mL～80 μg/mL范围内具有良好的线性，可以采用该方法进行抗真菌物质含量的计算，为下一步摸索其提取工艺时对该物质的跟踪检测提供了依据。

链霉菌NG-715所产生的抗真菌活性组分耐热和酸碱，而对紫外线较为敏感，在保存过程中要注意避光。李德舜等[17]研究结果显示，山东链霉菌产的抗真菌物质经90℃处理 10 min，UV照射1 h和经pH 1.0和pH 9.0处理后其抑菌活性都有明显下降。周利娟等[18]从海洋链霉菌GB-2的发酵液中分离纯化抗真菌物质，发现该物质物质在pH 1.0～pH 13.0，100℃和紫外照射24 h条件下抑菌活性几乎不变。可见菌株不同，产生的抗菌物质的稳定性也有很大差异。本研究为下一步对该抗真菌活性组分进行结构鉴定并探索其分离提取工艺提供了理论参考。

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Bioactivity and stability study of the antifungal substance produced by Streptomyces NG-715

YUAN Min, BIAN Hua, LI Jing, ZHANG Xue-peng, CHENG Lin
(Medical Experimental Center, Nanyang Institute of Technology, Nanyang 473004, China)

ObjectiveTo explore the bioactivity and stability of the antifungal substance produced by Streptomyces NG-715 as well as to establish the assay for biological activity detection.MethodsTake the antifungal substance as experimental materials, and test its minimum inhibitory concentration and minimum bactericidal concentration on four fungi strains including Saccharomyces cerevisiae, Penicillium citrinum, Aspergillus niger, Rhizopus sp. Aspergillus niger was used as indicator strain to measure the biological activity and stability of the antifungal substance.ResultsThe results showed that the MIC of the antifungal substance on four fungi strains including Saccharomyces cerevisiae,Penicillium citrinum,Aspergillus niger,Rhizopus sp were 1.25, 2.5, 3.75 and 3.75 μg/mL, respectively. The MBC of the antifungal substance on four fungi strains were 2.5, 10, 17.5 and 17.5 μg/mL, respectively. Linearity regress equation of the antifungal substance in Aspergillus niger was y=26.963 x-27.6，R2=0.9991. The antifungal substance was pH-stable, heat-stable but ultravio1 et-sensible.ConclusionThe results from this study will porvide useful information for the further extraction and analysis on the bioactive compound。

Streptomyces; antifungal substance; minimum inhibitory concentration; minimum bactericidal concentration; stability

Q 936

A

1005-1678(2014)02-0037-03

南阳理工学院2009年度青年基金项目(NG 2009 QNJJ 10)

袁敏，女，硕士，讲师，研究方向：抗生素提取，E-mail：ymin37@163.com。