乌骨鸡黑色素三步法提取及结构性状研究

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(1.南昌大学食品科学与技术国家重点实验室,江西南昌 330047； 2.南昌大学科学技术学院,江西南昌 330029)

乌骨鸡黑色素三步法提取及结构性状研究

黄宇玫2,田颖刚1,*,朱胜1

(1.南昌大学食品科学与技术国家重点实验室,江西南昌 330047； 2.南昌大学科学技术学院,江西南昌 330029)

采用“脱脂-酶解-酸解”三步法提取乌骨鸡黑色素,研究酸液脱除蛋白,分离乌骨鸡黑色素的工艺条件,通过透射电镜对乌骨鸡黑色素纯化效果进行观察,并用元素分析仪对其结构进行分析。结果表明：最佳脱脂工艺为乙醇回流脱脂4次,每次1h,料液比1∶2,此工艺条件下乌骨鸡油脂得率7.5%。脱脂后用蛋白酶C进行酶解,酸化的最优工艺盐酸浓度为2mol/L,回流时间为3h,固液比为1∶10,回流次数为4次,此条件下杂质脱除率最高,且条件温和,通过透射电镜可见三步法纯化的黑色素颗粒形态完整,边缘清晰平滑,无破坏痕迹,可用于降解和结构研究。根据元素分析仪推测乌骨鸡黑色素是一类有别于真黑色素及脱黑色素的特殊黑色素。

乌骨鸡,黑色素,提取,酶解,结构

乌骨鸡是江西省重要的地方资源,它与其他鸡种最大的区别在于其体内富含黑色素。李时珍在本草纲目里说,骨头与肉都呈黑色的乌骨鸡食用时药效最好,由此说明乌骨鸡黑色素是乌骨鸡发挥药效的一个最重要的物质基础,而近代科研工作者也发现乌骨鸡黑色素具有许多特殊的生理活性,如抗诱变、延缓衰老、抑制流感病毒等[1-3]。因此,乌骨鸡黑色素具有潜在的研究与应用价值。乌骨鸡黑色素是一类结构复杂且与蛋白质紧密结合的大分子多聚体[4]。目前,提取乌骨鸡黑色素的方法主要有盐酸水解法[5]、蛋白酶水解法[6]及双酶水解结合碱液除蛋白法等[7]。这些方法在提取乌骨鸡黑色素时只考虑了乌骨鸡黑色素获得,而忽略了对乌骨鸡的综合利用。本文结合前人的工作基础,运用“脱脂-酶解-酸解”三步法,为乌骨鸡的深入研究与开发提供借鉴,为促进江西省乌骨鸡产业的发展,深入开发我国特有资源做一些基础性研究。

1 材料与方法

1.1材料与仪器

乌骨鸡 70～80日龄,雌雄各半,购自江西泰和县；木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、复合蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶 广东诺维信酶制剂有限公司；无水乙醇、氯仿、甲醇、石油醚、无水乙醚、盐酸、酚酞、氢氧化钠 均为国产分析纯。

SXC12型绞肉机 上海双蝶厨具有限公司大溪分公司；XB220A电子分析天平 瑞士Prcisa；JJ-1精密增力电动搅拌器 常州国华电器有限公司；SHB-Ⅲ 循环水式多用真空泵 郑州长陈科工贸易有限公司；Anke TGL-16C 离心机 上海安亭科学仪器厂；SPI型傅里叶红外光谱仪 美国Perkin-Elmer；HITACHI H-600型透射电子显微镜 日本日立；DZF-6050型真空干燥箱 上海精宏实验设备有限公司；EuroVector EA3000元素分析仪 美国利曼;HH-4数显恒温水浴锅 常州国华电器有限公司;WH-861 微型漩涡混合仪 江西省日博工贸有限公司。

1.2实验方法

1.2.1 乌骨鸡原料脱脂工艺的优选 取泰和乌骨鸡,宰杀,去毛、头、爪、内脏,洗净,用绞肉机绞成肉泥,加入无水乙醇,90℃回流,趁热过滤,滤液浓缩并60℃真空干燥,得乌骨鸡油脂,滤渣60℃烘干得乌骨鸡干肉[8]。

选择回流次数、肉泥与无水乙醇的料液比、回流时间作为考察的因素,以所提油的得率为指标,采用L16(45)正交表安排实验,并对结果进行方差分析和显著性判断,以确定降解方法的最优组合,正交实验因素与水平见表1,相关数据用SPSS13.0软件进行处理。

表1 正交实验因素水平表

1.2.2 酶解制备粗黑色素的5种不同的蛋白酶及蛋白酶组合 取1.2.1最优条件所获乌骨鸡干肉6份,每份100g,加入6倍质量的水,90℃预煮30min,冷却至一定温度,参考文献[9],分别选择蛋白酶A-E进行水解,保温搅拌2h后90℃灭酶30min,趁热过滤,滤液浓缩并于60℃下真空干燥,称重,即获得乌骨鸡活性肽,滤渣烘干。以蛋白脱除率为指标初步筛选合适蛋白酶,蛋白酶用量及水解温度见表2。

蛋白脱除率(%)=乌骨鸡干肉重(g)-酶解残渣重(g)/乌骨鸡干肉重(g)×100

表2 蛋白酶用量及其水解温度

1.2.3 盐酸酸解纯化乌骨鸡黑色素工艺条件的确定 乌骨鸡黑色素与蛋白质结合紧密,提取得到的乌骨鸡黑色素粗品中含有大量的蛋白质,因此乌骨鸡黑色素的分离关键是脱除蛋白质,本实验采用盐酸酸解纯化乌骨鸡黑色素,分别对盐酸浓度、回流时间、固液比、回流次数4个指标做单因素考察,以杂质脱除率作为评价指标。

1.2.3.1 盐酸浓度单因素实验 称取干燥黑色素粗品6份,每份6g,分别加入浓度为0.5、1、2、4、6、8、10mol/L的盐酸溶液60mL,于90℃回流3h,冷却后过滤,滤液浓缩、水浴蒸干,称重,滤渣用蒸馏水洗涤至中性,60℃烘干。计算各组分杂质脱除率。

1.2.3.2 回流时间单因素实验 称取干燥黑色素粗品5份,每份6g,加入浓度为2 mol/L的盐酸溶液60mL,于90℃分别回流1、2、3、4、5h,冷却。滤液中干物质处理同1.2.3.1。

1.2.3.3 固液比单因素实验 称取干燥黑色素粗品5份,每份6g,分别以固液比为1∶4、1∶7、1∶10、1∶13、1∶16的比例加入2mol/L的盐酸溶液,于90℃回流3h,冷却。滤液中干物质处理同1.3.3.1。

1.2.3.4 回流次数单因素实验 称取干燥的黑色素粗品一份20g,以固液比1∶10的比例加入2mol/L的盐酸溶液,90℃回流3h,冷却,过滤。重复5次,滤液分别浓缩、水浴蒸干,称重。滤渣用蒸馏水洗涤至中性,60℃烘干。计算杂质脱除率。

1.2.4 研究乌骨鸡黑色素的理化性质

1.2.4.1 不同方法精制的乌骨鸡黑色素形态观察 比较双酶-碱液脱除蛋白法、本项目优化的脱脂-酶解-酸解三步精制法、酸提取法所得黑色素的形态差别。酸提取法：将乌骨鸡鸡肉、鸡皮剁细后用6mol/L盐酸按40mL/g比例浸泡8.0h,然后100℃水浴回流1.5h,在加热回流后进行快速冷冻,用小匙除去其油块得到乌骨鸡黑色素。

双酶-碱液脱除蛋白法：取泰和乌骨鸡肉泥加3倍的水,0.25%的木瓜蛋白酶,(63±1)℃酶解3h,降温至(54±1)℃,再加入0.15%的复合蛋白酶,继续酶解2h,升温煮沸0.5h,灭酶,静置分层,抽出上层黑色素悬浮液,在4800r/min条件下离心15min,弃去上清液,得黑色素粗品。取酶解后黑色素粗品5g,加入pH10的氢氧化钠溶液50mL,50℃水浴加热并搅拌2h,离心后得乌骨鸡黑色素。

脱脂-酶解-酸解三步精制法：取泰和乌骨鸡肉泥加2倍的无水乙醇,90℃回流4次,每次1h,趁热过滤,滤渣60℃烘干得乌骨鸡干肉。干肉加入6倍质量的水,90℃预煮30min,冷却至一定温度,选择蛋白酶C进行水解,保温搅拌2h后90℃灭酶30min,趁热过滤,滤液浓缩并于60℃下真空干燥得黑色素粗品,称取酶解后黑色素粗6g 至反应瓶,加入浓度为2mol/L的盐酸溶液60mL,90℃回流3 h,冷却后过滤,滤渣用蒸馏水洗涤至中性,60℃烘干得乌骨鸡黑色素。

取少量干燥的三种精制乌骨鸡黑色素,与适量乙醇混合,用超声的方法将样品尽量分散成均匀混合液,用玻璃毛细管吸取混合液滴2～3滴在微栅网上,置HITACHI H-600型透射电镜下进行观察并记录,工作电压75kV。

1.2.4.2 元素分析 取少量干燥的脱脂-酶解-酸解三步法精制乌骨鸡黑色素按JY/T 017-1996 元素分析仪通则[10]进行分析。

2 结果与讨论

2. 1正交实验优化结果

乌骨鸡鸡肉乙醇脱脂的正交实验结果及方差分析见表3、表4。由表3的极差分析结果可知,三个因素的主次顺序为：回流次数>回流时间>料液比。根据极差分析得到的乌骨鸡油得率最高的条件是：回流次数为4次,回流时间为1h,料液比为1∶2。经实验验证,在此条件下,乌骨鸡油脂得率为7.5%。根据方差分析结果可知：各因素在正交实验所选水平下,对乌骨鸡油脂得率都有影响,回流次数对其影响显著(p<0.05),但回流时间和料液比对其影响无统计学差异(p>0.05)。

表3 正交实验结果分析表

表4 正交实验结果的方差分析表

2. 2各种蛋白酶对蛋白的脱除效果

要获得比较纯净的黑色素,就必须尽可能的将与黑色素紧密相连的蛋白质等杂质去除。蛋白酶A、B、C、D、E及复合酶D+E的水解效果如图1。由结果可知,蛋白酶C的蛋白脱除率最高,可达59.79%,因此,选择蛋白酶C进行蛋白脱除。

图1 各种蛋白酶对蛋白的脱除效果

2.3乌骨鸡黑色素的提取工艺考察结果

2.3.1 盐酸浓度对杂质脱除率的影响 盐酸浓度对杂质脱除率的影响见图2,由图可知,盐酸浓度小于1mol/L时,盐酸浓度的变化对杂质脱除率的影响不大；当盐酸浓度大于1mol/L时,随着浓度的增加,杂质脱除率显著提高；在2mol/L处,脱除率显著增加,达到48.25%；继续增加盐酸浓度,杂质脱除率有缓慢增加的趋势。但盐酸浓度太大可能会对黑色素的结构造成破坏,且在实验操作方面有较大的危险性,综合以上因素,选择2mol/L为最佳盐酸浓度。

图2 盐酸浓度对杂质脱除率的影响

2.3.2 回流时间对杂质脱除率的影响 回流时间对杂质脱除率的影响见图3,由图可知,回流时间在3h之内,杂质脱除率呈大幅增高的趋势,且在该段时间内杂质脱除率与回流时间几乎成线性关系。回流3h后,杂质脱除率无明显增加,说明在此条件下即使增加回流时间也无法提高杂质的脱除率,一个原因可能随时间的延长反应液中盐酸浓度已经降低,已经无法继续水解杂质；另外一个原因是该盐酸浓度已经无法水解一些特殊的蛋白及以特殊结构连接在黑色素上的蛋白。因此,选择3h为最佳回流时间。

2.3.3 固液比对杂质脱除率的影响 固液比对杂质脱除率的影响见图4,由图可知,固液比在1∶4至1∶10之间,杂质脱除率呈逐渐增高的趋势,当固液比达到1∶10后,随着固液比的增大杂质脱除率增加非常缓慢,几乎不变,从经济角度考虑选择1∶10为最佳固液比。

图3 酸解时间对杂质脱除率的影响

图4 固液比对杂质脱除率的影响

2.3.4 回流次数对杂质脱除率的影响 回流次数对杂质脱除率的影响见图5,由图可知,随着回流次数的增加,杂质脱除率不断增加,但在初始阶段(回流1～3次),杂质脱除率与回流次数几乎呈线性正相关,当回流3次后,杂质脱除率趋于平缓,说明此时增加回流次数对杂质脱除率已无太大的影响。结合图6可知,当杂质脱除率与回流次数成正相关时,乌骨鸡黑色素粗品中含氮百分率与回流次数正好成负相关,说明脱除的杂质中含有大量的氮元素,可能是包裹在乌骨鸡黑色素周围的蛋白质,当回流次数超过4次后,乌骨鸡黑色素粗品中氮含量变化基本趋于平缓,考虑到蛋白含量太高会影响后期实验中乌骨鸡黑色素的降解及其降解产物的分离,为尽量减少杂质的干扰,因此,选择最佳回流次数为4次。

图5 回流次数对杂质脱除率的影响

图6 回流次数对乌骨鸡黑色素粗品氮含量的影响

2.4乌骨鸡黑色素性状的分析结果

2.4.1 不同方法精制的乌骨鸡黑色素的形态比较 如图7所示,在透射电镜下各种不同方法精制的乌骨鸡黑色素形态不同,采用双酶-碱液脱除蛋白法提取的黑色素(图中E-Alkali)在12000倍电镜下呈现块状形态,块状边缘棱角分明；采用本项目优化的三步精制法所获乌骨鸡黑色素(图中E-Acid)在12000倍时呈现为多个椭圆形颗粒的聚合物,且多聚体边缘呈现为椭圆形凹凸不平状,可隐约观察到黑色素颗粒形态。在40000倍电镜下与酸法提取的乌骨鸡黑色素(图中Acid)进行对比,黑色素颗粒数明显较多,其外部形态基本相似,这些椭球形颗粒形态完整,边缘清晰平滑,无破坏痕迹,可为后期乌骨鸡黑色素结构研究提供了性质稳定、纯净的原料来源。

图7 乌骨鸡黑色素透射电镜图

2.4.2 精制乌骨鸡黑色素的元素分析 元素分析表明,精制乌骨鸡黑色素中C、H、N三种元素的质量分数接近于合成真黑色素,但其S元素的含量高于合成真黑色素,又远低于脱黑色素。表明乌骨鸡黑色素可能是一类以真黑色素结构为主混合着少量脱黑色素结构的一类特殊黑色素。且乌骨鸡黑色素C元素的含量略高于其它两类黑色素,推测其含有脂肪族结构。

表5 三类黑色素中有机元素质量百分比

3 结论与讨论

目前乌骨鸡黑色素的结构尚不明确,被认为是一类与蛋白质结合紧密,且结构复杂的大分子多聚体[11-14]。盐酸水解法是早期使用较为广泛的提取黑色素的方法,盐酸可有效去除附着于黑色素周围的蛋白,但该法使用的盐酸浓度较高、酸解时间较长,可能会对黑色素的外部形态及内部化学结构造成破坏。因此有学者开始采用蛋白酶酶解技术提取黑色素。酶水解法水解温和,能尽量保持黑色素结构,但使用该法所获黑色素的蛋白质含量较高,其纯度往往不及盐酸水解法所获黑色素,这给黑色素的结构研究带来极大的不便。前期本课题组在此基础上采用双酶水解结合碱液除蛋白的方法提取分离乌骨鸡黑色素,该法只能一定程度上脱除黑色素周围的部分蛋白,制备的黑色素较适合进行功能研究,由于蛋白脱除不彻底不利于黑色素结构研究。本实验提出的“脱脂-酶解-酸解”三步法可将附着在乌骨鸡黑色素周围的蛋白质去除干净,投射电镜下可观察到游离的规则椭球颗粒的乌骨鸡黑色素,表明此法所获得的乌骨鸡黑色素周围无明显附着物,减少了多余蛋白质对乌骨鸡黑色素结构分析的影响,可为后期乌骨鸡黑色素的结构研究提供较为纯净、性质稳定的原材料。

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Three stage extraction and structural characters of melanin from black-bone silky fowl

HUANGYu-mei2,TIANYing-gang1,*,ZHUSheng1

(1.State Key Laboratory of Food Science and Technology,Nanchang University,Nanchang 330047,China; 2.Nanchang University College of Science and Technology,Nanchang 330029,China)

This study aimed to develop a method to extract melanin from black-bone silky fowl muscle by Skim-enzymatic hydrolysis and acid hydrolysis,to find better separation conditions of black-bone silky fowl melanin. The melanin was observed by Transmission Electron Microscope,and analyzed by element analyzer. The optimal conditions for protamex hydrolysis of black-bone silky fowl muscle were determined as follows:refluxing 4 times,refluxing time 1h,and solid-liquid ratio 1∶2.Under this condition the removal rate was 7.5%.Then it was found that more melanin with a lower protein level was prepared from black-bone silky fowl muscle by the protease C,optimal acidification condition was hydrochloric concentration 2mol/L,refluxing time 3h,liquid-solid ratio 1∶10,refluxing 4 times. Under this condition of the impurity removal rate was the highest. Through transmission electron microscopy the melanin by three-step purified was ellipsoidal and shape integrity particle,with clear and smooth borderline and without destruct. Element analysis of melanin showed that the melanin from black-bone silky fowl might be a specail melanin which was different with eumelanin and phomelanin.

black-bone silky fowl;melanin;extraction;enzymatic;structure

2013-06-28 *通讯联系人

黄宇玫(1983-)，女，硕士，讲师，研究方向：天然产物提取及药效研究。

国家自然科学基金项目(20962015)；江西省自然科学基金项目(2009GZN0087)；江西省教育厅科技项目(GJJ10308)。

TS251.55

：B

：1002-0306(2014)01-0249-05