血鹦鹉鱼肠道潜在益生菌的分离鉴定和培养条件优化

杨宁+姜芳燕+黄海

摘 要 从血鹦鹉鱼（Cichlasoma citrinellum×C.synspilum）肠道内分离了7种细菌，经纯化培养和感染实验确定其中1种为潜在益生菌（0129B），该细菌经形态特征、生理生化特征和16S rRNA序列分析，为革兰氏阳性菌，杆状，葡萄糖、甘露醇、明胶、硝酸盐（还原）、甘露糖等5项指标为阳性，麦芽糖、阿拉伯糖、木糖等15项指标为阴性；16S rRNA方法扩增出1 541 bp片段，鉴定其为坚强芽孢杆菌（Bacillus firmus）。通过比较研究不同盐度、温度、pH值对该菌生长的影响，初步确定该菌的合适培养条件为盐度10、温度40℃、pH值8。

关键词 血鹦鹉 ；益生菌 ；坚强芽孢杆菌；16S rRNA ；培养条件

分类号 S942.42

Isolation and Identification of Potential Probiotic from Intestine of

Cichlasoma citrinellum × C. synspilum and Optimization of Culture Conditions

YANG Ning1） JIANG Fangyan2） HUANG Hai1）

（1 Sanya Sci-Tech Academy of Hainan National Breeding and Multiplication， Sanya， 572000， China

2 School of Biological Science and Technology， Qiongzhou University， Sanya， 572022， China）

Abstract 7 kind of bacteria were isolated from intestine of Cichlasoma citrinellum×C.synspilum， 1 kind of bacteria named 0129B was potential probiotics by purification culture and infection experiments. Morphological characters， physiological and biochemical characteristics and 16S rRNA sequence were analyzed， gram positive， rod-shaped， 5 indicators were positive including glucose， mannitol， gelatin， nitrate （reduction） and mannose， 15 indicators were negative including maltose， arabinose， xylose， etc. 1541 bp fragment were amplified by 16S rRNA method， 0129B was identified as Bacillus firmus. The effection of salinity， temperature and pH on the growth of 0129B were studied， suitable culture conditions were identified， salinity 10， temperature 40℃， pH 8.

Keywords Cichlasoma citrinellum×C. Synspilum ； probiotic ； Bacillus firmus ； 16S rRNA ； culture conditions

血鹦鹉鱼（Cichlasoma citrinellum×C. synspilum）俗称红财神，为雄性红魔鬼（C. citrinellum）和雌性紫红火口（C. synspilum）的杂交种，成鱼体色主要呈红色，经人工处理还可呈黄色、绿色、橙色等多种颜色，形态有心形、元宝形、独角形等，是一种深受欢迎的淡水观赏鱼类。海南是我国最大的血鹦鹉鱼输出省份，但在其工厂化养殖过程中病害时有发生，严重影响该产业的发展。在提倡生态养殖、健康养殖的今天，益生菌在水产养殖应用中显示出了重要作用，国内外有大量关于益生菌在鱼类、虾蟹类和贝类养殖中应用的报道，如：曾东[1]从鲤鱼（Cyprinus carpio）肠道内分离的3种益生菌具有提高鲤鱼免疫机能和消化酶活性，改善其肠道菌群多样性等作用；Macey等[2]研究表明，益生菌对中间鲍（Haliotis midae）具有促进生长和提高抗病力作用；Iehata等[3]研究表明，益生菌可提高日本大鲍（Haliotis gigantea）的肠道内环境，进而影响肠道菌群分布；刘君等[4]从凡纳滨对虾肠道分离出2种益生菌，拌料投喂可提高虾体免疫酶活性和抗病毒能力。本研究通过从血鹦鹉鱼肠道内分离出细菌，经注射感染试验找到潜在益生菌，并研究其合适的培养条件，以期为益生菌的筛选和应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验用鱼

血鹦鹉鱼来源于三亚市南繁科学技术研究院观赏鱼重点实验室，选取无发病史的健康个体，体长（11.72±1.17）cm，体宽（6.10±0.84）cm，体重（32.25±1.50）g。于水族箱内暂养一周后用于试验。

1.1.2 培养基

益生菌分离和培养所用的培养基配方如下（g/L）：牛肉膏3.0、酵母提取物 1.0 g、胰蛋白胨 5.0、NaCl 5.0、琼脂15.0。

1.2 方法endprint

1.2.1 肠道细菌的分离

先用75%酒精将血鹦鹉鱼体表消毒，剖开腹部及肠道，在无菌条件下，用接种环接种肠道内溶物于固体培养基上，30℃培养24 h，挑取菌落形态特征不同的菌落，纯化2次，获得菌种用15%甘油-80℃冰箱保藏备用。

1.2.2 注射感染试验

纯化后的细菌经扩大培养后配成菌浓度为1×108 CFU/mL，腹腔注射健康血鹦鹉鱼，0.2 mL/尾，对照组注射同剂量的生理盐水，每组20尾，每组设一平行。观察记录一周内的成活情况。

1.2.3 潜在益生菌的形态观察

对上述注射感染试验中未出现血鹦鹉死亡的细菌进行革兰氏染色和显微观察，记录该菌的形态特征。

1.2.4 潜在益生菌的生理生化鉴定

生理生化鉴定指标有：葡萄糖、麦芽糖、甘露醇、木糖、半乳糖、蔗糖、阿拉伯糖、山梨醇、鼠李糖、西蒙氏枸椽酸盐、纤维二塘、VP、苯丙氨酸、明胶、硝酸盐（还原）、蜜二糖、甘露糖、棉子糖、水杨素、尿素共20项。

1.2.5 潜在益生菌的16S rRNA分子生物学鉴定

菌株16S rRNA分析参照文献[5]的方法。通过常规PCR后，采用2%的琼脂糖电泳，切胶回收，将目的片段送深圳华大基因有限公司测序。测序结果提交GenBank，获取登录号。并与已发表的16S rRNA序列进行比对，采用Mega 5.0软件构建系统发育树，确定菌株的分子分类地位。

1.2.6 潜在益生菌的合适培养条件研究

试验共设盐度、温度、pH值等3个因子，温度分别为20、25、30、35和40℃，盐度分别为0、5、10、15和20，pH值分别为5.0、6.0、7.0、8.0和9.0。考察温度影响时，盐度和pH分别是5和7；考察盐度影响时，温度和pH分别是30℃和7；考察pH影响时，温度和盐度分别是30℃和5，200 r/min振荡培养24 h后，以平板涂布计数法计算出原菌液浓度，比较不同培养条件对细菌生长的影响。

1.2.7 数据统计与处理

试验数据采用（平均值±标准差）表示，用SPSS 19进行数据分析，进行单因素方差分析（ANOVA）和Duncan多重比较，P<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 细菌分离和注射感染试验结果

从肠道分离得到7种细菌，菌落形态特征、所占比例和注射感染的致死率见表1。通过注射感染试验，只有0129B一种细菌对血鹦鹉的致死率为0%，认为是潜在益生菌，命名为0129B。

2.2 菌株0129B的鉴定

菌株0129B革兰氏染色结果为阳性，短杆状，大小为1.2 μm×0.6 μm，常多个菌株链状排列。

生理生化特征分析结果表明（表2），该菌株的葡萄糖、硝酸盐（还原）、明胶、甘露醇、甘露糖、蔗糖6项指标均为阳性，其余检测指标呈阴性。根据《伯杰氏手册》[6]和《常见细菌系统鉴定手册》[7]等资料，初步鉴定菌株0129B为坚强芽孢杆菌（Bacillus firmus）。

以菌株0129B基因组DNA为模板，采用16S rRNA的通用引物进行PCR扩增，目的片段经测序分析，确定得到的目的片段长为1 451 bp（图1）。

通过BLAST，将与菌株0129B的16S rRNA同源性较高的同一属3种细菌和亲缘关系较远的16种细菌选出，用MEGA 5.0软件对这20种序列进行同源性比对，Neighbor-joining法构建系统发育树，自举分析（Bootstrap）1 000次，0129B与坚强芽孢杆菌相似性100%（图2）。

综合菌株的形态特征、生理生化特征和16S rRNA分析，确定所分离的潜在益生菌菌株0129B为坚强芽孢杆菌（GenBank登录号：KC916741）。

2.3 盐度对菌株0129B生长的影响

研究结果表明（图3），4种不同盐度对菌株0129B生长具有显著影响（P<0.05），其中盐度为10时，细菌的培养浓度最高，当盐度降低到5时，菌数大量减少，当盐度增加到15时，菌数稍有降低，当盐度增加到20时，菌数大量减少，表明该菌株的合适培养盐度为10。

2.4 不同温度下细菌的生长状况

研究结果表明（图4），4种不同温度对菌株0129B生长具有显著影响（P<0.05），细菌浓度随温度的升高而增加，25℃时浓度最低，40℃时达到最高，表明该菌株的合适培养温度为40℃。

2.5 不同pH值下细菌的生长状况

培养基的酸碱度对微生物的生长代谢和产酶有很大的影响，pH可以改变细胞膜的通透性、营养物质的溶解性，影响微生物对营养物质的吸收。培养基分别设置5、6、7、8、9五个不同pH值条件进行，各组差异显著。从图5可以看出，pH值由5～8细菌数量呈增加趋势，pH值为8的菌落数量增加最为明显，当pH值为9时又突然下降。

3 讨论与结论

3.1 潜在益生菌的分离和鉴定

本试验成功从血鹦鹉鱼肠道内分离到潜在益生菌菌株，通过细菌形态特征观察、生理生化和16S rRNA的测定，最终鉴定菌株0129B为坚强芽孢杆菌。有关坚强芽孢杆菌的研究较多，大部分集中在该菌对养殖对象和养殖水体影响。李桂英等[8]研究表明，饲料中添加坚强芽孢杆菌可显著提高凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）的非特异性免疫水平和抵抗对虾白斑综合症病毒的能力。孙艳[9]研究表明，坚强芽孢杆菌活菌和溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）活菌结合使用，可显著搞高凡纳滨对虾抗对虾白斑综合症病毒感染的能力。柴鹏程等[10]研究表明，用拌有坚强芽孢杆菌的饲料投喂凡纳滨对虾，能显著提高对虾的生长率和淋巴器官中STAT基因的表达。郭静[11]等通过富集培养，从养殖水体中分离到坚强芽孢杆菌，该菌对氨氮和亚硝态氮的降解率分别达80%和90%以上。不过，有关鱼源性坚强芽孢杆菌的研究较少，本文从血鹦鹉肠道中分离得到的1株坚强芽孢杆菌，该菌对血鹦鹉无致病性，为下一步开展该菌的活性研究奠定了基础。endprint

3.2 潜在益生菌株0129B的培养条件优化

本文研究了盐度、温度和pH值对菌株0129B生长的影响，确定了该菌的合适培养条件为盐度10、温度40℃、pH 8。其中，菌株0129B的合适培养盐度与李坤等[12]对益生细菌沼泽红假单胞菌（Rhodopseudanonas palustris）的研究结果相似；其合适培养温度与赵先锋[13]所分离的坚强芽孢杆菌的最适生长温度（30～40℃）相似，但与钟硕良等[14]对益生菌哈维氏弧菌（Vibro harveyi）的温度影响研究结果不同；其合适pH值与沈锦玉[15]对光合细菌类球红细菌（Rhodobacter sphaeroides）试验结果相似，但与赵先锋[12]所分离的坚强芽孢杆菌最适pH 5.4～7.2不同。

通过感染试验，初步验证了本试验分离的坚强芽孢杆菌对水产养殖对象无致病性，并通过对其生长环境条件的研究，初步掌握了该益生菌体外培养中生长变化规律，为大量培养提供了理论依据。本试验中的菌种仅是潜在益生菌，实际应用中该菌的益生作用，如对宿主的生长、非特异性免疫和水环境的影响还有待进一步研究。

参考文献

[1] 曾 东. 鲤益生菌的筛选、生物学特性及作用机理的研究[D]. 成都：四川农业大学，2009.

[2] Macey B M， Coyne V E. Improved growth rate and disease resistance in farmed Haliotis midae through probiotic treatment[J]. Aquaculture， 2005， 245： 249-261.

[3] Iehata S， Inagaki T， Okunishi S， et al. Improved gut environment of abalone Haliotis gigantea through Pediococcus sp. Ab1 treatment[J]. Aquaculture， 2010， 305： 59-65.

[4] 刘 君，宋晓玲，刘 莉，等. 2株消化道优势菌对凡纳滨对虾免疫酶活性和抗白斑综合征病毒感染力的影响[J]. 水产学报，2012，36（3）：444-450.

[5] 杨 宁，黄 海，张 希，等. 尼罗罗非鱼嗜水单胞菌的病原分离鉴定和药敏试验[J]. 水产科学，2014，33（5）：306-310.

[6] 布坎南. 伯杰细菌鉴定手册（第九版）[M]. 中国科学院微生物研究所译. 北京：科学出版社，1994：745-746.

[7] 东秀珠，蔡妙英. 常见细菌系统鉴定手册[M]. 北京：科学出版社，2001：162-171.

[8] 李桂英，宁晓玲，孙 艳，等. 几株肠道益生菌对凡纳滨对虾非特异性免疫力和抗病力的影响[J]. 中国水产科学，2011，18（6）：1 358-1 367.

[9] 孙 艳. 对虾抗病微生物的筛选及其作用机制的研究[D]. 青岛：中国海洋大学， 2012.

[10] 柴鹏程，宋晓玲. 饲料中添加芽孢杆菌PC465对凡纳滨对虾生长和STAT基因表达的影响[J]. 渔业科学进展， 2013，34（3）：97-103.

[11] 郭 静，熊 焰，李 华. 养殖水体中水质净化菌的筛选和鉴定[J]. 水利渔业，2008， 28（4）：105-106.

[12] 李 坤，王福强，张 辉. 环境条件对光合细菌生长的影响[J]. 大连大学学报，2011，32（3）：79-82.

[13] 赵先锋. 利用农业副产品发酵坚强芽孢杆菌及其用于加强生物絮团培养的研究[D]. 青岛：中国海洋大学，2011.

[14] 钟硕良，陈良忠，周 宸. 环境因子对发光细菌的生长及日本对虾仔虾感染死亡率的影响[J]. 中国水产科学，2001，8（1）：41-45.

[15] 沈锦玉，刘 向，尹文林，等. 光合细菌HZPSB菌株的分离鉴定及其生长特性的测定[J]. 科技通报，2005，21（1）： 69-73.endprint

3.2 潜在益生菌株0129B的培养条件优化

本文研究了盐度、温度和pH值对菌株0129B生长的影响，确定了该菌的合适培养条件为盐度10、温度40℃、pH 8。其中，菌株0129B的合适培养盐度与李坤等[12]对益生细菌沼泽红假单胞菌（Rhodopseudanonas palustris）的研究结果相似；其合适培养温度与赵先锋[13]所分离的坚强芽孢杆菌的最适生长温度（30～40℃）相似，但与钟硕良等[14]对益生菌哈维氏弧菌（Vibro harveyi）的温度影响研究结果不同；其合适pH值与沈锦玉[15]对光合细菌类球红细菌（Rhodobacter sphaeroides）试验结果相似，但与赵先锋[12]所分离的坚强芽孢杆菌最适pH 5.4～7.2不同。

通过感染试验，初步验证了本试验分离的坚强芽孢杆菌对水产养殖对象无致病性，并通过对其生长环境条件的研究，初步掌握了该益生菌体外培养中生长变化规律，为大量培养提供了理论依据。本试验中的菌种仅是潜在益生菌，实际应用中该菌的益生作用，如对宿主的生长、非特异性免疫和水环境的影响还有待进一步研究。

参考文献

[1] 曾 东. 鲤益生菌的筛选、生物学特性及作用机理的研究[D]. 成都：四川农业大学，2009.

[2] Macey B M， Coyne V E. Improved growth rate and disease resistance in farmed Haliotis midae through probiotic treatment[J]. Aquaculture， 2005， 245： 249-261.

[3] Iehata S， Inagaki T， Okunishi S， et al. Improved gut environment of abalone Haliotis gigantea through Pediococcus sp. Ab1 treatment[J]. Aquaculture， 2010， 305： 59-65.

[4] 刘 君，宋晓玲，刘 莉，等. 2株消化道优势菌对凡纳滨对虾免疫酶活性和抗白斑综合征病毒感染力的影响[J]. 水产学报，2012，36（3）：444-450.

[5] 杨 宁，黄 海，张 希，等. 尼罗罗非鱼嗜水单胞菌的病原分离鉴定和药敏试验[J]. 水产科学，2014，33（5）：306-310.

[6] 布坎南. 伯杰细菌鉴定手册（第九版）[M]. 中国科学院微生物研究所译. 北京：科学出版社，1994：745-746.

[7] 东秀珠，蔡妙英. 常见细菌系统鉴定手册[M]. 北京：科学出版社，2001：162-171.

[8] 李桂英，宁晓玲，孙 艳，等. 几株肠道益生菌对凡纳滨对虾非特异性免疫力和抗病力的影响[J]. 中国水产科学，2011，18（6）：1 358-1 367.

[9] 孙 艳. 对虾抗病微生物的筛选及其作用机制的研究[D]. 青岛：中国海洋大学， 2012.

[10] 柴鹏程，宋晓玲. 饲料中添加芽孢杆菌PC465对凡纳滨对虾生长和STAT基因表达的影响[J]. 渔业科学进展， 2013，34（3）：97-103.

[11] 郭 静，熊 焰，李 华. 养殖水体中水质净化菌的筛选和鉴定[J]. 水利渔业，2008， 28（4）：105-106.

[12] 李 坤，王福强，张 辉. 环境条件对光合细菌生长的影响[J]. 大连大学学报，2011，32（3）：79-82.

[13] 赵先锋. 利用农业副产品发酵坚强芽孢杆菌及其用于加强生物絮团培养的研究[D]. 青岛：中国海洋大学，2011.

[14] 钟硕良，陈良忠，周 宸. 环境因子对发光细菌的生长及日本对虾仔虾感染死亡率的影响[J]. 中国水产科学，2001，8（1）：41-45.

[15] 沈锦玉，刘 向，尹文林，等. 光合细菌HZPSB菌株的分离鉴定及其生长特性的测定[J]. 科技通报，2005，21（1）： 69-73.endprint

3.2 潜在益生菌株0129B的培养条件优化

本文研究了盐度、温度和pH值对菌株0129B生长的影响，确定了该菌的合适培养条件为盐度10、温度40℃、pH 8。其中，菌株0129B的合适培养盐度与李坤等[12]对益生细菌沼泽红假单胞菌（Rhodopseudanonas palustris）的研究结果相似；其合适培养温度与赵先锋[13]所分离的坚强芽孢杆菌的最适生长温度（30～40℃）相似，但与钟硕良等[14]对益生菌哈维氏弧菌（Vibro harveyi）的温度影响研究结果不同；其合适pH值与沈锦玉[15]对光合细菌类球红细菌（Rhodobacter sphaeroides）试验结果相似，但与赵先锋[12]所分离的坚强芽孢杆菌最适pH 5.4～7.2不同。

通过感染试验，初步验证了本试验分离的坚强芽孢杆菌对水产养殖对象无致病性，并通过对其生长环境条件的研究，初步掌握了该益生菌体外培养中生长变化规律，为大量培养提供了理论依据。本试验中的菌种仅是潜在益生菌，实际应用中该菌的益生作用，如对宿主的生长、非特异性免疫和水环境的影响还有待进一步研究。

参考文献

[1] 曾 东. 鲤益生菌的筛选、生物学特性及作用机理的研究[D]. 成都：四川农业大学，2009.

[2] Macey B M， Coyne V E. Improved growth rate and disease resistance in farmed Haliotis midae through probiotic treatment[J]. Aquaculture， 2005， 245： 249-261.

[3] Iehata S， Inagaki T， Okunishi S， et al. Improved gut environment of abalone Haliotis gigantea through Pediococcus sp. Ab1 treatment[J]. Aquaculture， 2010， 305： 59-65.

[4] 刘 君，宋晓玲，刘 莉，等. 2株消化道优势菌对凡纳滨对虾免疫酶活性和抗白斑综合征病毒感染力的影响[J]. 水产学报，2012，36（3）：444-450.

[5] 杨 宁，黄 海，张 希，等. 尼罗罗非鱼嗜水单胞菌的病原分离鉴定和药敏试验[J]. 水产科学，2014，33（5）：306-310.

[6] 布坎南. 伯杰细菌鉴定手册（第九版）[M]. 中国科学院微生物研究所译. 北京：科学出版社，1994：745-746.

[7] 东秀珠，蔡妙英. 常见细菌系统鉴定手册[M]. 北京：科学出版社，2001：162-171.

[8] 李桂英，宁晓玲，孙 艳，等. 几株肠道益生菌对凡纳滨对虾非特异性免疫力和抗病力的影响[J]. 中国水产科学，2011，18（6）：1 358-1 367.

[9] 孙 艳. 对虾抗病微生物的筛选及其作用机制的研究[D]. 青岛：中国海洋大学， 2012.

[10] 柴鹏程，宋晓玲. 饲料中添加芽孢杆菌PC465对凡纳滨对虾生长和STAT基因表达的影响[J]. 渔业科学进展， 2013，34（3）：97-103.

[11] 郭 静，熊 焰，李 华. 养殖水体中水质净化菌的筛选和鉴定[J]. 水利渔业，2008， 28（4）：105-106.

[12] 李 坤，王福强，张 辉. 环境条件对光合细菌生长的影响[J]. 大连大学学报，2011，32（3）：79-82.

[13] 赵先锋. 利用农业副产品发酵坚强芽孢杆菌及其用于加强生物絮团培养的研究[D]. 青岛：中国海洋大学，2011.

[14] 钟硕良，陈良忠，周 宸. 环境因子对发光细菌的生长及日本对虾仔虾感染死亡率的影响[J]. 中国水产科学，2001，8（1）：41-45.

[15] 沈锦玉，刘 向，尹文林，等. 光合细菌HZPSB菌株的分离鉴定及其生长特性的测定[J]. 科技通报，2005，21（1）： 69-73.endprint