GDNF基因诱导大鼠骨髓间充质干细胞促周围神经再生的实验研究

尚修超，顾加祥，张乃臣，刘宏君，田 恒，潘俊博

（1.扬州大学医学院，江苏 扬州225001；2.扬州大学临床医学院 江苏 扬州225001）

周围神经损伤是临床常见病症，损伤后如不进行及时有效的修复，损伤神经支配区肌肉必将萎缩，造成神经肌肉功能障碍，给后续康复带来不利的影响［1］。胶质细胞源性神经营养因子（glial cell linederived neurotrophic factor，GDNF），是一种有效的神经营养因子，对神经系统神经元的分化、发育、生长和存活具有重要作用［2］。BMSCs经GDNF基因诱导后可分化为神经细胞，在周围神经损伤模型中可显著促进损伤神经再生。

1 材料与方法

1.1 实验动物与试剂

SD大鼠均由扬州大学医学院动物房提供，DAPI福建迈新，HPIAS－1000彩色病理图文分析系统，电子天平，冰冻切片机，扫描电镜，

1.2 建立大鼠坐骨神经损伤模型

大鼠均用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，俯卧位固定。碘伏消毒皮肤，作左大腿切口，约3cm，钝性分离皮下，沿股后外侧肌间隙钝性分离到腘窝上缘显露坐骨神经约20mm，轻轻游离，于坐骨神经梨状肌下缘5mm持针器咬合三齿十次，将坐骨神经夹伤达透明薄纸状，8－0普里林显微缝线标记坐骨神经夹伤两端，大鼠左下肢反应迟钝，屈伸力量大大减弱，达到造模目的。术后分笼饲养，每日肌注适量抗生素。

1.3 坐骨神经功能指数（SFI）与腓肠肌湿质量恢复率

术后4周、8周观察以下指标：①选择印迹清晰的足印分别测量正常足和伤足三个指标：足迹长度（PL）：足尖到足跟的最大距离；足趾宽度（TS）：第1－5趾的距离；中间足趾宽度（TT）：第2－4趾的距离。②坐骨神经指数（SFI）＝－38.3［（EPLNPL）/NPL］＋109.5［（ETS－NTS）/NTS］］＋13.3［（EIT－NIT）/NIT］－8.8。其中坐骨神经指数值为0～－11%表示神经功能完全正常，－100%表示神经功能完全丧失，－11%～－100%表示部分神经功能恢复。③腓肠肌湿质量恢复率（%）＝手术侧腓肠肌湿质量/对侧正常腓肠肌湿质量×100%。

1.4 BMSCs的分离、培养与鉴定

将大鼠置于75%的酒精中消毒5min。无菌条件下取出双侧胫骨和股骨，并剪去两端，用5ml注射器抽取DMEN培养基5ml反复冲洗骨髓腔，将冲洗液缓慢置于离心管中，2 500r/min离心20 min，收集中间单层细胞，PBS冲洗2次，应用含10%胎牛血清的DMEM培养基3ml重新悬浮细胞，接种于6孔板内，置于室温、5%CO2、饱和湿度下常规培养。24h后更换新培养液去除非贴壁细胞，以后每隔3d换液一次。当1012d时，细胞生长融合达培养板孔90% ，用0.25%胰蛋白酶消化传代，3－4d传代一次。镜下观察细胞生长情况。

BMSCs经三代体外传代培养后，接种在无菌的6孔培养板中，达到80%融合时进行BMSCs向神经细胞分化的诱导实验。细胞换液后行载GDNF基因的脂质体转染，继续培养两周，于室温、5%CO2、饱和湿度培育箱内孵育，每3d全量换液一次，连续培养。

1.5 BMSCs注入大鼠损伤再生室模型

微量注射器将等量浓缩细胞打入坐骨神经再生室模型。对照组：未经诱导的BMSCs；实验组：GDNF基因诱导后的BMSCs。微量注射器注入完成后，将切口缝合，继续饲养8周。

1.6 腓肠肌冰冻切片DAPI染色

每组大鼠腓肠肌组织做一套切片，切好的组织粘附于防脱片上，晾干，DAPI染色10min，晾干后，中性树脂封片，镜下观察切片结果。

1.7 坐骨神经再生神经纤维分析

坐骨神经行Marsland和LFB染色，黑色的轴突和蓝色的髓鞘在病理图文自动分析系统放大600倍下测量各组坐骨神经损伤段再生有髓神经纤维的数目、轴突直径和再生髓鞘厚度结果。

1.8 坐骨神经切面扫描电镜观察

术后8周取各组坐骨神经于损伤标记8－0普里林边缘切下，2.5%戊二醛固定，用PBS浸洗2次，每次10min，再用4℃预冷的1% 锇酸。在4℃固定1h，然后用PBS浸洗2次，每次10min。系列梯度酒精（50%、70% 、80%、90%、100%）脱水，每种浓度酒精通过2次，每次15min。乙酸戊酯：乙醇为1∶1中通过一次30min，纯戊酯通过30min，CO2临界点干燥，粘样喷金上镜观察。

1.9 统计分析

SFI和腓肠肌湿质量恢复率结果采用方差分析，统计软件采用SPSS15.0。

2 结果

2.1 腓肠肌湿质量恢复率和SFI检测

术后4和8周分别测量每组的SFI和腓肠肌湿重恢复率，结果如下。

表1 术后各组大鼠腓肠肌湿重恢复率比较（±s，n＝10，%）

表1 术后各组大鼠腓肠肌湿重恢复率比较（±s，n＝10，%）

＊P0.01， 。

8w对照组术后4w 术后27.800±0.128 12.500±0.111实验组 35.202±0.027＊ 32.600±0.017＊

表2 术后各组大鼠坐骨神经指数（SFI）比较（±s，n＝10，%）

表2 术后各组大鼠坐骨神经指数（SFI）比较（±s，n＝10，%）

＊P＜0.01，有显著差异。

8w对照组术后4w 术后－91.46±1.36 －80.24±2.24实验组 －87.02±1.81 －73.00±2.51＊

图1 腓肠肌冰冻切片DAPI染色结果（实验组）

通过表1可以看出，实验组可显著延缓大鼠腓肠肌湿质量减少速度，其恢复率情况明显优于对照组，差异有显著性意义（P＜0.01）。由表2可知，术后4周四组大鼠SFI恢复情况无明显差异，但术后8周，实验组的SFI恢复情况明显优于对照组，差异有显著性意义（P＜0.01）。

2.2 腓肠肌冰冻切片DAPI染色结果

400倍镜下观察可见实验组（图1）较未诱导对照组（图2）细胞核更多，而对照组腓肠肌萎缩明显。

图2 腓肠肌冰冻切片DAPI染色结果（对照组）

2.3 坐骨神经再生神经纤维分析结果

GDNF基因诱导组与未诱导对照组相比，GDNF基因诱导组再生神经纤维计数、轴突直径和髓鞘厚度大于未诱导对照组（见表3），差异有显著性意义（P＜0.01）。

表3 再生神经纤维病理图像分析（±s）

表3 再生神经纤维病理图像分析（±s）

＊P＜0.01

组别 轴突直径（μm） 髓鞘厚度（μ㎡） 有髓神经纤维计数（根）2.14±0.15 0.99±0.12 65.54±5.01实验组 3.21±0.08＊ 1.63±0.11＊ 86.54±5.50对照组＊

图3 坐骨神经再生神经纤维分析结果（实验组）

图4 坐骨神经再生神经纤维分析结果（对照组）

实验组（图3）神经纤维数、轴突直径和髓鞘厚度明显大于对照组（图4），且排列更加整齐。

2.4 坐骨神经切面扫描电镜观察结果

扫描电镜下观察实验组（图5）可见明显高放电神经丝交联，比对照组（图6）神经再生更加明显。

3 讨论

胶质细胞源性神经营养因子（glial cell line－derivedneurot rophic factor，GDNF），对多巴胺能神经元、运动神经元等多种神经元均具有促存活及损伤保护作用，对感觉神经元有营养作用，因此其可应用于神经损伤和神经退行性疾病的治疗［4－7］。

图5 坐骨神经切面扫描电镜观察结果（实验组）

图6 坐骨神经切面扫描电镜观察结果（对照组）

通过DAPI染色，GDNF基因诱导组较未诱导对照组细胞核更多，并且未诱导对照组腓肠肌萎缩更加明显。在坐骨神经再生神经纤维分析中，GDNF基因诱导组坐骨神经损伤段再生有髓神经纤维的数目、轴突直径和再生髓鞘厚度明显增加，并且排列比较整齐。扫描电子显微镜下，GDNF基因诱导组有明显高放电神经丝交联，神经再生更加明显。GDNF基因诱导组可显著延缓大鼠腓肠肌湿质量减少速度。术后8周，GDNF基因诱导组的SFI恢复情况明显优于对照组。由上述结果可知，经GDNF基因诱导BMSCs组各方面检测指标均较对照组为好，其中诱导后实验组扫描电镜下观察周围神经再生更加明显。因此，GDNF基因诱导的间充干细胞对周围神经再生有着显著的疗效。

DAPI是一种能够与DNA强力结合的荧光染料，它能粘附在DNA双螺旋的小沟区。DAPI作为一种能与DNA分子特异结合的荧光染料，无明显细胞毒性，可穿透活细胞胞膜，所以它可用于活细胞和固定细胞的染色。DAPI标记细胞由于操作简便，被标记细胞的生命活动无明显影响，可直接观察，费用低廉，因此得到广泛使用。DAPI未导致细胞死亡和没有破坏细胞骨架结构有关。细胞的弹性模量的变化受各种生理、病理以及外界物理、化学、生物等因子刺激的影响，其中细胞骨架结构动力学变化以及骨架重排对细胞弹性影响最显著。DAPI穿透活细胞膜与DNA特异结合没有影响细胞的骨架结构，所以DAPI染色对细胞的弹性模量没有影响，同时可通过DAPI的染色初步区分出细胞核大小。因此，本实验可见GDNF基因诱导组较未诱导对照组细胞核更多，明显可见未诱导对照组腓肠肌萎缩明显。

骨髓间充质干细胞（bone marrow derivedmesenchymal stem cells，BMSCs），是来源于骨髓的单胚层多能干细胞，能自我增殖。因其取材容易，能迅速体外培育和增殖，同时具有多向分化潜能，并且避免了伦理方面的冲突。因此，其在组织工程、细胞移植和基因治疗方面有十分广阔的前景［8－16］。

然而，BMSCs向神经细胞的诱导分化过程中仍有一些不足之处［17－26］：①没有BMSCs的特异性标记分子，而且没有标准的分离纯化、培养扩增和鉴定的方法；②BMSCs可跨胚层分化为神经元样细胞，有望成为神经细胞替代治疗的种子细胞，但诱导后的细胞是否具有神经细胞的生理功能尚待进一步研究；③BMSCs分化为神经细胞仍处在实验研究阶段。

同时，在后续实验中我们应对BMSCs诱导分化后的神经细胞内是否含有神经递质进行检测：①该物质是否存在于轴突末梢内；②神经兴奋时该物质是否能释放至突触间隙，并且作用于突触后膜上的特异性受体；③神经元中是否有合成该物质的前体和中间物，是否有合成酶和分解酶；④神经末梢内是否有对该物质迅速灭活的机制系统；⑤该物质作用于突触后膜时是否能模拟神经生理效应。

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