γ－干扰素释放试验在结核病诊断中的临床价值

周 政，李建英，韩 飞，王文昕，易兴鑫（重庆三峡中心医院，重庆万州 404000）

越来越多的学者开始关注结核病的诊断和治疗，而结核分枝杆菌的实验室检测和药敏测定一直是研究的热点和难点。传统的检测方法如结核菌素皮肤试验（TST）、抗酸染色涂片镜检、分枝杆菌培养鉴定、结核菌核酸检测等方法由于其各自的局限性，已逐渐不能完全满足临床实验室的需求，临床急需一种灵敏度高、特异性高、报告时间短的新方法，用于结核病患者的诊断和鉴别诊断。随着免疫学和分子生物学的发展，一种以T淋巴细胞免疫应答为基础的γ－干扰素（IFN－γ）释放试验（IGRAs）逐渐被人们所认识。IGRAs是一种新的辅助诊断结核病的方法，它可以定性或定量检测出机体是否含有结核分枝杆菌的特异性记忆T细胞，而这种T细胞对于机体是否感染结核分枝杆菌有着很强的指示性。本文旨在通过比较分析IGRAs、TST、抗酸染色涂片镜检和分枝杆菌培养在结核病患者中的诊断性能，初步评价IGRAs用于结核病诊断的临床价值，现报道如下。

1 资料与方法

1．1 对象 选取2012年1月至2013年8月来本院就诊的肺疾病患者，根据临床诊断分为肺结核组：根据我国《肺结核诊断标准》（WS288－2008）确诊为活动性肺结核患者32例、非活动性肺结核患者28例，其中男36例，女24例，年龄15～68岁，平均（32．5±28．4）岁。非结核肺疾病组：根据临床症状、体征、X线胸片、CT、肺功能试验等检查，确诊为肺炎患者18例、慢性阻塞性肺疾病21例、肺气肿10例、支气管扩张症5例，合计54例，其中男32例，女22例，年龄20～75岁，平均（46．3±25．5）岁。健康对照组：35例，均来自于本院健康体检者，其中男18例，女17例，年龄18～22岁，平均（20．2±1．7）岁。

1．2 实验方法

1．2．1 结核菌素皮肤试验 所有实验对象均做TST试验，采用Moutax法，在前臂的掌侧面皮内接种0．1mL（含5个结核菌素单位）标准PPD（购自成都生物制品研究所），72h后检查反应结果，测量硬结直径。若硬结直径大于或等于10mm，则判定为TST试验阳性。

1．2．2 抗酸染色涂片 肺结核组患者就诊时被告知将做该试验，取随机痰、夜间痰和第二日晨痰三个标本，按《全国临床检验操作规程》（第三版）进行涂片、抗酸染色（购自珠海贝索生物技术有限公司）和镜检。在10×100倍油镜下至少观察100个视野，结核分枝杆菌呈红色，其他细菌和细胞呈蓝色。按照1984年国内统一标准进行报告：全视野（或100个视野）未找到抗酸菌报告“－”；全视野发现1～2个时报告抗酸菌的个数；全视野发现3～9个报告“＋”；全视野发现10～99个报告“＋＋”；每视野发现1～9个报告“＋＋＋”；每视野发现10个以上报告“＋＋＋＋”。

1．2．3 分枝杆菌培养 以肺结核组患者的晨痰作分枝杆菌培养试验，采用全自动快速结核菌培养系统BACTEC MGIT 960（购自美国BD公司）及其配套试剂，严格按仪器说明书进行操作。仪器自动判断报阳，且经抗酸染色确认为阳性，即为该标本分枝杆菌培养阳性；若经28日培养仪器判断为阴性，但抗酸染色确认为阳性时，也报告该标本分枝杆菌培养阳性。

1．2．4 IGRAs 所有实验对象均做IGRAs，在采集全血标本2h内进行标本前处理。整个试验采用酶联免疫斑点试验（ELISPOT），试剂盒购自英国牛津免疫公司，其原理是用结核分枝杆菌特异性早期分泌靶向抗原6（ESAT－6）和培养过滤蛋白（CFP－10）肽段分别和共同刺激T细胞产生免疫应答，再用ELISPOT法计数分泌IFN－γ的T淋巴细胞的数量。试验严格按试剂说明书进行操作。首先用绿头管（肝素抗凝，BD公司提供）采集受试者4mL静脉血，在4h内分离出外周血单个核细胞（PBMCs），然后用培养液调整至约2．5×106／mL左右，加入到试剂盒的微孔板内。每例标本需要4个微孔板，分别加入培养液（空白对照）、植物血凝集素（阳性对照）、抗原A（ESAT－6）和抗原B（CFP－10），然后于5%CO2培养箱中孵育16～20 h。第2天取出微孔板，磷酸盐缓冲液（PBS）洗脱，加入碱性磷酸酶标记的γ－干扰素特异性抗体，4℃孵育2h，PBS洗脱，以酶联斑点显色，计数斑点形成细胞（SFC）。当任一检测孔达到以下标准即可判定为阳性：（1）空白对照孔的斑点数小于5个，检测孔斑点数减去空白对照孔斑点数大于或等于6个；（2）空白对照孔的斑点数大于或等于6个，检测孔的斑点数必须大于空白对照孔斑点数的2倍。

1．3 统计学方法 采用SPSS17．0统计软件，计数资料的分析采用χ2检验，检验水准α＝0．05。TST和IGRAs的检测一致性比较采用kappa检验。

2 结 果

2．1 4 种方法的诊断性能比较 IGRAs对肺结核病的诊断灵敏度 为 88．3%（53／60），与 TST（66．7%，χ2＝12．85，P＜0．01）、抗酸染色（31．7%，χ2＝25．65，P＜0．01）和分枝杆菌培养（46．7%，χ2＝18．43，P＜0．01）3种方法相比，差异具有统计学意义。而特异性上，IGRAs（89．9%）也高于 TST（75．3%）。因此总体来说，在4种方法中，IGRAs对肺结核病的诊断性能最高。TST和IGRAs对肺结核感染一致性比较：结果见表1。TST和IGRAs对诊断肺结核的检测一致性较差，IGRAs的诊断灵敏度和特异性均显著高于TST。差异有统计学意义（P＜0．05）。

表1 TST和IGRAs对肺结核感染一致性比较四格表（n）

2．2 IGRAs对活动性肺结核的诊断性能 见表2。IGRAs对活动性肺结核的诊断灵敏度（93．8%）显著高于非活动性肺结核（82．1%），差异有统计学意义（χ2＝5．74，P＜0．05）。

表2 IGRAs对活动性肺结核的诊断性能表

3 讨 论

目前我国结核病年发患者数约为130万，占全球发病的14．3%，位居全球第2位，仅次于印度。尤其是近年来，结核病疫情日益恶化，究其原因，一方面是艾滋病、肿瘤等疾病的逐渐增多、器官移植的广泛开展、高强度免疫抑制剂和大剂量抗肿瘤药物的使用，导致患者免疫功能逐渐低下，结核易感性增加；另一方面是耐药性结核病患者尤其是耐多药（MDR）结核病患者数量的急剧上升。因此，结核病的诊断和治疗再次成为全球性的医疗难题。

传统的结核菌检测方法有TST、抗酸染色涂片检查和分枝杆菌培养等。TST是近一个世纪来应用最广泛的传统方法，但TST存在着皮内注射风险、观察结果需时较长以及给患者带来不便等缺点，同时因使用纯化蛋白衍生物（PPD）在鉴别诊断结核分枝杆菌感染与非结核分枝杆菌感染及卡介苗（BCG）接种方面还存在特异性差的问题。抗酸染色涂片和分枝杆菌培养是结核病诊断的病原学标准，但存在着取样困难、阳性率低、操作繁琐、无法区分非结核分枝杆菌（如常见的牛分枝杆菌等）感染等问题。随着分子生物学技术的快速发展，包括PCR、基因芯片、探针杂交、DNA测序等在内的新兴分子学手段也已直接用于结核病的检测，但存在着设备昂贵、操作复杂、取样困难等问题，使其临床推广应用具有一定的局限性。因此，临床迫切需要一种新的诊断性能高、简便快速的实验室检测方法。

随着免疫学和分子生物学的发展，IGRAs作为一种具有高潜力的新诊断方法应运而生。IGRAs是利用结核分枝杆菌的特异性抗原在体外刺激受检者全血或外周血单个核细胞，使T淋巴细胞产生大量IFN－γ，然后用酶联免疫吸附法或酶联免疫斑点法检测IFN－γ浓度或计数分泌IFN－γ细胞个数的方法。IGRAs的代表性试验有两种：一种是澳大利亚Cellestis公司的 QuantiFERON－TB Gold（QFT－G）和新一代 QuantiFERONTB Gold In－Tube（QFT－IT）方法，利用酶联免疫吸附法检测外周血淋巴细胞经结核分枝杆菌特异性抗原刺激后产生的IFN－γ，已分别于2005和2007年被美国FDA批准为结核筛查试验；另一种是英国Oxford Immunotech公司的T－SPOT．TB检测法，主要测量经结核分枝杆菌特异性抗原体外刺激后能产生IFN－γ的外周血致敏T淋巴细胞的数量，在2008年被美国FDA批准作为IGRAs的新方法［1］。T－SPOT使用结核分枝杆菌特有的片段即缺失区域（RD）基因编码的早期分泌靶抗原6和培养过滤蛋白10作为抗原特异性抗原，而QFT－G另外还使用TB7．7抗原［2－3］。由于这些抗原是非结核分枝杆菌感染和卡介苗接种患者不会产生的，所以IGRAs对于检测个体对结核分枝杆菌感染的免疫应答，尤其是非结核分枝杆菌感染和卡介苗接种患者的特异性高于传统的TST方法。这两种技术在发达国家均得到很好的利用，特别是在涂片阴性的结核患者及处于潜伏期的结核接触人群的筛选。有相关系统评价指出，对于处于潜伏期的结核患者，QFT－IT技术检出的灵敏度可以达到70%以上，运用T－SPOT．TB检出的灵敏度更可高达90%，并且不受疫苗接种的影响。而从特异性角度来说，前者的特异性在未接种疫苗人群特异性高达99%，在接种了疫苗人群中其特异性依旧高达96%；而后者实验特异性也可达到93%。这些数据都提示，这个新的技术有助于提高结核的检出率。

在本研究中，IGRAs对肺结核病的诊断灵敏度为88．3%（53／60），显著高于 TST（66．7%）、抗酸染色（31．7%）和分枝杆菌培养（46．7%），而其特异性也显著高于 TST（89．9%∶75．3%），表明IGRAs对肺结核病的诊断性能显著高于TST。而抗酸染色和分枝杆菌培养从理论上来说，是结核病感染的病原学标准，特异性应为100%，但由于非结核分枝杆菌感染的影响，其特异性也会降低。本实验由于实验对象的依从性问题，没有对非结核肺疾病组和健康对照组进行该两项试验。从表2中可以看出，IGRAs对活动性肺结核的诊断灵敏度高达93．8%，显著高于非活动性肺结核（82．1%）。整个研究结果与国内外学者的结果相仿［4－8］。Mori等［9］研究表明，在216例有卡介苗接种史而无结核菌暴露史的健康者中，其全血经ESAT6和CFP10共刺激后，仅有4例显示阳性结果，特异性为98．1%，而在118例经分枝杆菌培养病原学证实的结核病患者中，有105例出现了阳性结果，灵敏度达到89%，其灵敏度与本研究相仿，但特异性高于本研究结果。因此，从国内外报道及本研究结果都可以看出，IGRAs对肺结核感染具有较高的诊断和鉴别诊断价值，特别是结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌属感染的鉴别诊断中。Lein等［10］报道，27例肺结核患者中有16例（59%）可诱导产生高浓度的IFN－γ，而在8例鸟分枝杆菌复合群性肺感染患者中未发现阳性结果。本研究中，由于病例收集的原因，仅对肺结核患者进行了分析，对肺外结核感染未涉及，而Chapman等［11］报道证实IGRAs在活动性肺结核、肺外结核和潜伏性结核感染以及免疫抑制的结核患者中均可检出。此外，当结核分枝杆菌被清除后，致敏T淋巴细胞就会消失，此时检测致敏T淋巴细胞也可反映出机体是否清除了结核分枝杆菌，从而进行临床疗效评估［12－13］。

与TST相比，IGRAs的灵敏度高、特异性高，检测时间较短（24～48h），不需受试者回访，而且不会激发记忆性免疫反应等优点，因此已越来越多地被临床用于替代传统的TST。但同样需要看到，IGRAs也存在着固有的一些缺点：（1）需要的全血量大，对于婴幼儿患者很难采集到充足的标本量；（2）标本处理需要及时，一般要求在2h内就需要对标本进行前处理；（3）在孵育过程中，可能会触发一些免疫功能，如T细胞增殖、细胞因子的产生等，有可能对检测结果产生影响；（4）IGRAs对于实验室条件、操作人员、试验流程等要求较高，且试剂成本高昂，对于临床的广泛推广应用具有一定的局限性。另外，欧洲CDC指南还特别提示，在大多数临床情况下，IGRAs阴性并不能完全排除活动性结核感染。

综上所述，IGRAs具有灵敏度高、特异性高、检测时间短、标本易于采集等特点，是一种逐渐替代传统TST方法的结核诊断的新的辅助试验，可用于结核分枝杆菌感染的诊断、鉴别诊断和疗效观察，但由于其临床意义的局限性，如何正确使用和判断结果必须成为临床关注的问题。

［1］ 肖荣，陈瑜．干扰素释放试验诊断HIV携带者并发结核的研究进展［J］．临床检验杂志，2011，29（8）：612－614．

［2］ Ozekinci T，Ozbek E，Celik Y．Comparison of tuberculin skin test and a specific T－cell－based test，T－Spot［J］．TB，for the diagnosis of latent tuberculosis infection．J Int Med Res，2007，35（5）：696－703．

［3］ Bruzzese E，Bocchino M，Assante LR，et al．Gamma interferon release assays for diagnosis of tuberculosis infection in immune－compromised children in a country in which the prevalence of tuberculosis is low［J］．J Clin Microbiol，2009，47（7）：2355－2357．

［4］ Kim SH，Lee So，Park IA，et al．Diagnostic usefulness of a T－cell－based assay for latent tuberculosis infection in kidney trausplant candidates ketore transplantation［J］．Transpl Infect Dis，2010，12（2）：113－119．

［5］ 吴多池，黄守凤，郭爱珍．γ－干扰素释放试验诊断结核分枝杆菌感染的临床意义［J］．广东医学，2011，32（10）：1317－1319．

［6］ 蒋英，张胜男，黄小玲，等．γ干扰素释放试验用于结核病诊断的临床应用价值［J］．中国药业，2012，21（13）：88－90．

［7］ Ariga H，Kawabe Y，Nagai H，et al．Diagnosis of active tuberculous serositis by antigen－specific interferon－gamma response of cavity fluid cells［J］．Clin Infect Dis，2007，45（12）：1559－1567．

［8］ Krenke R，Safianowska A，Paplinska M，et al．Pleural fluid adenosine deaminase and interferon gamma as diagnostic tools in tuberculosis pleurisy［J］．J Physiol Pharmacol，2008，59（Suppl 6）：349－360．

［9］ Mori T，Sakatani M，Yamagishi F，et al．Specific detection of tuberculosis infection：an interferon－gamma－based assay using new antigens［J］．Am J Respir Crit Care Med，2004，170（1）：59－64．

［10］Lein AD，von Reyn CF，Ravn P，et al．Cellular immune responses to ESAT－6discriminate between patients with pulmonary disease due to Mycobacterium avium complex and those with pulmonary disease due to Mycobacterium tuberculosis［J］．Clin Diagn Lab Immunol，1999，6（4）：606－609．

［11］Chapman AL，Munkanta M，Wilkinson KA，et al．Rapid detection of active and latent tuberculosis infection in HIV－positive individuals by enumeration of Mycobacterium tuberculosis－specific T cells［J］．AIDS，2002，16（17）：2285－2293．

［12］Kobashi Y，Mouri K，Yagi S，et al．Transitional changes in T－cell responses to Mycobacterium tuberculosis－specific antigens during treatment［J］．J Infect，2009，58（3）：197－204．

［13］Diel R，Loddenkemper R，Nienhaus A．Evidence－based comparison of commercial interferon－gamma release assays for detecting active TB：a metaanalysis［J］．Chest，2010，137（4）：952－968．