利用优化的5′-RACE实验定位副溶血弧菌基因的转录起始位点

李杰，张义全，高鹤，王丽，胡小许 ，周冬生

1.中国疾病预防控制中心 传染病预防控制所，传染病预防控制国家重点实验室，北京 102206；2.军事医学科学院 微生物流行病研究所，病原微生物生物安全国家重点实验室，北京 100071

基因是遗传物质的最小功能单位，它通过转录和翻译而对生物体表型产生专一性效应。转录是DNA指导下的RNA合成过程，起始于DNA模板的一个特定起点，即基因的转录起始位点。对原核生物而言，其mRNA 5′端的碱基即为其转录起始位点。

在前期研究中[1-5]，我们通常采用引物延伸实验来确定基因的转录起始位点。但引物延伸实验需要利用放射性核素对特异性引物的5′端进行标记，这不仅极易产生放射性废物污染，而且对实验者的健康也有较大伤害。因此，该方法并不是寻找基因转录起始位点的最优选择。5′-cDNA末端快速扩增（5′-rapid-amplification of cDNA ends，5′-RACE）实验也可以用来确定基因的转录起始位点，该方法通过在mRNA的5′端连接接头（Adapter），而后联合利用逆转录、巢式PCR和DNA测序技术，即可最终确定基因的转录起始位点，具有灵敏度高和特异性好的优点。然而，目前市售5′-RACE试剂盒均是针对真核生物mRNA的帽子结构而设计的。由于细菌的mRNA无帽子结构，市售试剂盒并不能直接应用于原核生物。

副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus，VP菌）是一种广泛分布于浅海海域及海产品中的革兰阴性弧菌，也是引起食物中毒的首要病原菌，能引起以腹泻为主要症状的急性胃肠炎[6]。VP菌具有多种毒力因子，主要包括Ⅲ型分泌系统（T3SS1和T3SS2）、直接耐热溶血素（TDH）和TDH相关溶血素（TRH）。……