一测多评法测定黄柏中5种生物碱

吴珊珊，胡昌江，吕非非，高 源，李文兵

(成都中医药大学药学院，四川成都 611137)

黄柏为芸香科植物黄皮树Phellodendron chinense Schneid.的干燥树皮，具有清热燥湿、泻火除蒸、解毒疗疮的功效［1］，为临床常用药物。其主要成分有小檗碱、黄柏碱、木兰花碱、巴马汀、药根碱等生物碱类，其中含有量最高的为小檗碱［2-4］。现代药理研究表明，盐酸小檗碱具有抗炎，降血压，降血糖和免疫调节等作用，黄柏碱与降压作用有关，而巴马汀、药根碱为抗病原微生物的有效成分［5-6］。2010年版《中国药典》以小檗碱和黄柏碱的量作为黄柏质量控制指标，尚不能全面反应黄柏的质量。目前，虽有文献报道，采用HPLC法同时测定黄柏中多种生物碱的量［7-8］，但需要多种对照品，限制了实际工作中的应用。

本实验以小檗碱为参照物，得出黄柏碱、木兰花碱、药根碱、巴马汀与小檗碱之间的相对校正因子(F)，同时测定了黄柏中木兰花碱、黄柏碱、药根碱、巴马汀、小檗碱的量，建立一测多评法(QAMS)［9-17］，从而降低检测成本和时间，提高方法的实用性。

1 仪器与试药

Agilent 1200高效液相系统，Shimadzu LC-20AT高效液相系统，FE20梅特勒-托利多pH计，Sartorius BP211D电子分析天平，KQ-300E超声仪(40 kW)，乙腈、甲醇为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。

木兰花碱(Must-12022901)、盐酸黄柏碱(Must-12021407)、盐酸药根碱(Must-10122001)、盐酸巴马汀(Must-11122703)和盐酸小檗碱(Must-111212110)均购自成都曼斯特生物科技有限公司，纯度为98%。黄柏样品1～3号购自广西，4～7号购自贵阳，8～9号购自湖北，10号购自湖南，11～30号购自四川荥经、青城山、都江堰、彭州、泸州等地药材市场和不同的饮片公司。经本校生药室教研室卢先明教授鉴定为黄皮树Phellodendron chinense Schneid.的干燥树皮。

2 分析方法与结果

2.1 一测多评方法学考察

2.1.1 色谱条件 Phenomenex Luna C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5μm)，Thermo C18(4.6 mm×250 mm，5μm)，Diamonsil C18(2)(4.6 mm×250 mm，5μm)。柱温 30 ℃，体积流量1mL/min，检测波长280 nm，流动相A为乙腈-0.05 mol/L磷酸二氢钾(KH2PO4)(45∶55)(每100 mL中加入0.4 g十二烷基硫酸钠，调节pH至4.8)，流动相 B为乙腈-0.05 mol/L KH2PO4(55∶45)(每100 mL中加入0.4 g十二烷基硫酸钠，调节pH至4.5)，梯度洗脱，0～12 min(0 B)，12～18 min(0～100%B)，18～40 min(100%B)，40～42 min(100% ～0 B)，42～48 min(0 B)。上述色谱条件下，各组分分离度良好，色谱图见图1。

图1 混合对照品(A)和样品(B)的HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of mixed reference substances(A)and samples(B)

2.1.2 对照品溶液的制备 取木兰花碱、盐酸黄柏碱、盐酸药根碱、盐酸巴马汀和盐酸小檗碱5种生物碱，精密称定 10.24、9.8、9.09、10.92、14.42 mg，分别置于10 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度。再稀释至适当质量浓度。精密移取稀释后的5个对照品溶液适量配为混合对照品溶液。将上述溶液保存于4℃冰箱中备用。

2.1.3 供试品溶液的制备 取黄柏药材粉末(过4号筛)约0.5 g，精密称定，置于100 mL锥形瓶，精密加入盐酸-甲醇(1∶100)的混合液40 mL，称定质量，超声30 min，冷却后加盐酸-甲醇(1∶100)的混合液补足失质量，过滤，取续滤液过0.45μm 滤膜，5μL 进样。

2.1.4 线性范围考察 精密吸取上述混合对照品溶液40、20、10、8、6、4、2、1μL，进样分析，每个质量浓度进样3次，取平均值。以进样量对峰面积积分值进行回归处理，得小檗碱、木兰花碱、黄柏碱、药根碱、巴马汀的标准曲线见表1。

表1 黄柏中5种生物碱类成分的标准曲线Tab.1 Standard curves of five alkaloids

2.1.5 校正因子计算 以小檗碱为内标，计算小檗碱对木兰花碱、黄柏碱、药根碱、巴马汀的校正因子，见表2。

表2 黄柏生物碱相对校正因子Tab.2 Relative correction factors(RCF)of alkaloids

2.1.6 精密度试验 精密吸取混合对照品溶液5μL于同一天内连续进样5次，记录木兰花碱、黄柏碱、药根碱、巴马汀、小檗碱的峰面积，得出日内精密度分别为 0.68%、0.74%、1.30%、0.93%和0.81%。表明仪器较为稳定。

2.1.7 稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液5μL分别于配制后的0、2、4、8、12、24、48 h测定峰面积，计算得木兰花碱、黄柏碱、药根碱、巴马汀、小檗碱稳定性的 RSD分别为0.66%、0.34%、0.38%、0.11%和0.63%。表明供试品在48 h内稳定。

2.1.8 重复性试验 称取黄柏药材粉末(过4号筛)约0.5 g共6份，精密称定，按“2.1.3”项下制备样品，测定，木兰花碱、黄柏碱、药根碱、巴马汀、小檗碱的 RSD分别为1.9%、2.5%、1.3%、1.2%和2.2%。表明该方法重复性好。

2.1.9 加样回收率试验 精密称取0.5 g湖北产黄柏药材粉末(小檗碱含有量3.81%)6份，加盐酸-甲醇(1∶100)的混合液40 mL，称定质量，超声30 min，冷却后加盐酸-甲醇(1∶100)的混合液补足失质量，过滤，取滤液2 mL，加1 mL盐酸小檗碱(1.007 mg/mL)定容到10 mL，再次超声30 min(重现提取过程)，0.45μm滤膜过滤，进样，测定，计算，得加样回收率分别为97.1%、98.8%、 96.9%、 100.9%、 99.0%、 95.6%、RSD为1.9%。

2.2 校正因子的重现性考察

2.2.1 色谱柱及高效液相色谱仪考察 取“2.1.2”项下混合对照品溶液，进样20、10、8、6、4、2μL，按“2.1.5”项下计算小檗碱对木兰花碱、黄柏碱、药根碱、巴马汀的校正因子。不同高效液相色谱系统和不同品牌柱子的相对校正因子见表3。

2.2.2 待测组分色谱峰的定位 利用5个成分色谱行为的不同，以小檗碱为基准峰计算各个化合物的相对保留时间，即确定其在色谱图中的位置。结果见表4。

表3 不同仪器和色谱柱测得相对校正因子Tab.3 RCFs determined by different instruments and columns

表4 不同仪器和色谱柱测得相对保留值Tab.4 Relative retention time(RTR)determined by different instruments and columns

2.3 一测多评法与标准曲线法测定结果的比较按供试品溶液处理方法制备样品，分别精密吸取供试品溶液各5μL注入高效液相色谱仪测定。采用标准曲线法和一测多评法分别计算黄柏中木兰花碱、黄柏碱、药根碱、巴马汀、小檗碱的量，结果见表5。

测定结果表明，同一样品中木兰花碱、黄柏碱、药根碱、巴马汀、小檗碱的量差异较大，小檗碱的量最高，部分地区不含或含少量药根碱和巴马汀。同时，不同产地黄柏生物碱量差异比较大，川产黄柏小檗碱和黄柏碱量较其他产区高，其中以四川荥经产黄柏含有量最高。

3 讨论

实验过程中，考察了盐酸-甲醇(1∶100)、乙酸-甲醇(1∶100)、60%乙醇和甲醇4种不同提取溶剂，采用超声提取30 min，权衡5种成分提取效率，结果以盐酸-甲醇(1∶100)作为溶剂提取较为完全。同时，考察了乙腈-磷酸盐溶液作为流动相系统进行分析，其峰型较差，色谱峰重叠，改为乙腈-磷酸二氢钾(十二烷基硫酸钠，磷酸调节pH)后，峰型改善，但木兰花碱和黄柏碱色谱峰重叠，无法得到有效分离。因为将木兰花碱与黄柏碱、巴马汀与小檗碱同时有效分离需要不同浓度的有机相和不同pH。因此，考察不同pH不同乙腈浓度的混合流动相作为洗脱剂，最后实验确定以乙腈-0.05 mol/L KH2PO4(45∶55)(每100 mL中加入0.4 g十二烷基硫酸钠，调节pH至4.8)为流动相A，乙腈-0.05 mol/L KH2PO4(55∶45)(每100 mL中加入0.4 g十二烷基硫酸钠，调节pH至4.5)为流动相B，作为流动相，使各成分完全分离，且峰形较好。

表5 标准曲线法和一测多评法测定黄柏中生物碱的比较Tab.5 Contents of alkaloids by external standard method and QAMS

本实验考察了不同色谱柱、液相色谱系统对小檗碱与木兰花碱、黄柏碱、药根碱和巴马汀之间相对校正因子的影响，验证一测多评法在黄柏质量控制中的可行性和技术适应性。标准曲线法和一测多评法测定30批黄柏中生物碱的结果表明，一测多评法与标准曲线法得到的数值之间没有显著性差异，说明建立的校正因子具有较好的可信度，一测多评法能同时测定黄柏中小檗碱、木兰花碱、黄柏碱、药根碱和巴马汀的量。

实验中，通过对5个成分的吸收光谱并结合3D图进行分析，选择280 nm作为检测波长，5个生物碱都有吸收。黄柏碱及木兰花碱与另3个生物碱母核结构不同(巴马汀、药根碱、小檗碱)，UV响应值也存在不同，但一测多评法利用数学上的转换关系推算校正因子，并不关乎化学结构是否异同，故而虽然每个成分都不能实现最优的波长检测，但在一定含有量范围内仍然是可以实现较为准确的定量。

黄柏中小檗碱与其他生物碱相比含有量差异很大，一次分离测定常导致低含有量成分低于检测灵敏度或超出线性范围，很难同时兼顾。同时，多组分定量测定中无法兼顾各组分选用最佳波长，确实会降低各组分的定量限，但在本实验中的30个样品中并未受到该因素的影响，相比每个成分单独测定而言，换来了较高的分析效率。在对照品缺乏的情况下，此方法可以作为一个新模式用于黄柏药材的多成分定量。

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