二甲氨基乙醇和复方氨基酸溶液对衰老大鼠皮肤MMP-1和TIMP-1mRNA表达的影响

刘 肃， 樊亚红， 赵彩玲， 陈振雨， 柳大烈

实验研究

二甲氨基乙醇和复方氨基酸溶液对衰老大鼠皮肤MMP-1和TIMP-1mRNA表达的影响

刘 肃， 樊亚红， 赵彩玲， 陈振雨， 柳大烈

目的依据Mesotherapy的治疗理念，观察真皮内注射二甲氨基乙醇(DMAE)和复方氨基酸溶液(AA)对D-半乳糖诱导的化学性衰老大鼠皮肤MMP-1和TIMP-1mRNA表达的影响。方法80只wistar大鼠随机分入正常对照组、衰老对照组、衰老治疗组。衰老治疗组从注射D-半乳糖后第18天开始，在大鼠两侧臀部皮肤分别皮内注射0.2%DMAE+AA、0.1%DMAE+AA、0.2%DMAE、0.1%DMAE、AA、生理盐水(NS)，每周1次，连续4周。观察各组皮肤组织学、真皮厚度、羟脯氨酸(Hyp)、MMP-1、TIMP-1 mRNA和成纤维细胞核增殖抗体(PCNA)表达水平的变化。结果真皮内注射0.1%DMAE+AA、0.2%DMAE+AA，可使衰老大鼠真皮厚度、Hyp含量和MMP-1mRNA表达水平显著增加，而对TIMP-1mRNA和PCNA的表达没有影响。结论在衰老大鼠真皮内注射0.2%DMAE+AA、0.1%DMAE+AA，可促进老化、变性胶原蛋白分解，重构衰老皮肤组织结构，使皮肤中胶原蛋白含量显著增多，真皮厚度增加，具有一定延缓皮肤衰老的作用。

二甲氨基乙醇； 复方氨基酸； MMP-1； TIMP-1； Mesotherapy

本研究以D-半乳糖诱导的亚急性化学性大鼠衰老皮肤模型为研究对象[1]，依据Mesotherapy的治疗理念，分别在衰老大鼠臀部皮肤真皮内注射0.2%二甲氨基乙醇 (dimethylaminoethano， DMAE)+复方氨基酸溶液(amino acid, AA)、0.1%DMAE+AA、0.2%DMAE、0.1%DMAE、AA和生理盐水(Normal saline，NS)，以研究其对皮肤MMP-1和TIMP-1mRNA表达的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物 7周龄清洁级雄性wistar 大鼠 80只 ,体质量(200±20)g,由青岛市药物研究中心提供。

1.2 主要实验仪器 RT PCR分析仪(宝生物工程大连有限公司)、超声细胞粉碎仪(SONICS公司， 美国)、Neofuge 13R低温高速离心机(上海力康生物医疗科技控股有限公司)。

1.3 主要试剂 DMAE、D-半乳糖(国药集团化学试剂有限公司)；3.48%AA(广东利泰药业有限公司)；羟脯氨酸(hydroxyproline， Hyp)剂盒(南京建成生物科技公司)；MMP-1、TIMP-1和内参照β-action引物(上海生物工程技术服务公司)；PCNA试剂盒(PROTEINTECH公司,美国)。

1.4 实验动物分组及处理 实验动物分组情况见表1。预处理：1～7组大鼠每天注射D-半乳糖125 mg/kg，共42 d； 2～7组大鼠在18 d予10%水合氯醛麻醉,5%硫酸钠脱毛，在臀部两侧制作直径3 cm的圆形文身，于文身皮肤真皮层多点均匀注射相应治疗试剂1 ml。每周1次，连续4周。衰老对照组和正常对照组只做相同的抓取和麻醉。所有动物自由取食、饮水。42 d后，切取皮肤标本，留小部分制作石蜡切片，其余组织迅速置于液氮冰冻保存。

表1 实验动物分组及处理

1.5 Hyp含量测定 大鼠皮肤Hyp含量的测定参照南京建成生物工程公司试剂盒说明书进行。

1.6 Real Time-PCR试验步骤 ①提取总RNA；②逆转录； ③PCR 扩增: PCR反应总体系为20 μl, 含cDNA 2 μl 、ROX Reference Dye 0.4 μl、 Taq 酶 10 μl 、dd H2O 6 μl 、 上游和下游引物各 0.8 μl。引物序列如下。MMP-1,上游引物:5.-ctcccttggactcactcattcta-3.,下游引物:5.-agaacatcacctctcccctaaac-3.,产物长度227 bp；TIMP-1,上游引物:5.-tggcatcctcttgttgctatc-3.,下游引物:5.-cgaatcctttgagcatcttagtc-3.,产物长度191 bp ;内参照 β-action,上游引物:5.-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA-3.,下游引物: 5.-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3.,产物长度150 bp。扩增条件为预变性95 ℃ 30 s，PCR反应95 ℃ 30 s、65 ℃ 30 s (40个循环 )。结果采用2-△△CT方法分析基因表达数据。

1.7 测量方法 采用Simple PCI图像分析系统，在4×10倍数下测量真皮厚度，真皮层厚度为真皮乳头和表皮突到浅筋膜层距离的平均值；在40×10放大倍数下，对PNCA免疫组化染色皮肤切片中呈阳性染色的成纤维细胞进行测量。相同倍镜下，每个病理切片随机选取5个视野，每个视野随机选取5处进行测量，取平均值。

2 结果

2.1 动物外观 衰老各组大鼠体质量减轻，体形瘦小，毛色枯黄，活动减少，行动迟缓，精神萎靡，具有老化的特征。正常组大鼠体形明显大于衰老各组大鼠，毛色光泽且多动活泼。

2.2 组织学差异 与正常对照组相比，衰老各组表现为表皮变薄，细胞层数减少，真皮变薄，皮肤胶原纤维排列疏松，胶原纤维密度降低，胶原束细长、断裂、走向平直。其中，衰老0.1% DMAE+AA组、衰老0.2%DMAE+AA组上述现象好于衰老对照组(图1)。

2.3 真皮厚度 与衰老对照组相比，衰老0.1%DMAE+AA组和衰老0.2%DMAE+AA组真皮厚度较高(P<0.01)；与正常对照组相比，所有衰老组的真皮厚度均较低(P<0.01)，见表2。

2.4 Hyp含量 与其他衰老组相比，正常对照组、衰老0.1% DMAE+AA组、衰老0.2%DMAE+AA组皮肤中Hyp含量均较高(P<0.05)；正常对照组与衰老0.2%DMAE+AA组、衰老0.2%DMAE+AA组与衰老0.1% DMAE+AA组之间差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

2.5 DMAE和AA对MMP-1 、TIMP-1mRNA表达水平的影响 与衰老对照组相比，正常对照组、衰老0.1% DMAE+AA组、衰老0.2%DMAE+AA组皮肤中MMP-1 mRNA表达水平较高(P<0.01)。与衰老0.2%DMAE+AA组相比，正常对照组和衰老0.1% DMAE+AA组皮肤中MMP-1 mRNA表达水平的差异无统计学意义(P>0.05)，而其他衰老各组表达水平均较低(P<0.01)。正常对照组TIMP-1的mRNA表达水平显著高于衰老各组(P<0.01)，而衰老各治疗组表达水平的差异均无显著性意义(P>0.05)。见表2，图1。

2.6 DMAE和AA对成纤维细胞PCNA表达的影响 正常对照组PCNA的表达高于衰老各组(P<0.01)；衰老各组之间差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

3 讨论

Mesotherpy通过直接在真皮层注射具有良好的生物相容性和能够完全吸收的合适产品，来维护或者恢复健康、青春的皮肤纹理，从而达到美容、抗衰老的效果。它不但显效快，疗效明显，而且微创、恢复期短，受到广大爱美人士和整形医师的欢迎。但对于其确切的疗效及明确的作用机制，文献报道亦不多[2-4]，还有部分学者认为该方法不具有抗衰老的作用[5-6]。

DMAE是维生素B胆碱的类似物，是乙酰胆碱的前体。临床试验发现，外用3%DMAE凝胶16周，可明显改善前额皱纹、眶周细纹、唇的厚度和形状外观，并验证了连续应用12个月的安全性[7]。外用3%DMAE凝胶，可使皮肤超声剪切波速度增加，提示其可增加皮肤的紧实度[8]。但亦有文献报道，2.5～10.0 mmol/L的DMAE即可导致培养的兔成纤维细胞内产生大量空泡；3%(337 mmol/L)DMAE外用也能引起兔耳表皮细胞的空泡化[9]；并发现DMAE可抑制培养的成纤维细胞增殖，加剧凋亡，认为较高浓度的DMAE具有一定的细胞毒性[10]。目前，临床应用的DMAE均为外用品，其大剂量用药不但增加其相应的不良反应和毒性，也增加了医疗负担。因此，本研究依据Mesotherapy的治疗理念，通过真皮内注射小剂量、低浓度的DMAE，直接作用于拟治疗的部位，降低其浓度和用量，同时还结合AA同步注射，以减轻真皮内注射DMAE对靶细胞的细胞毒性，并为其提供多种氨基酸作为营养物质。

图1 各治疗组组织学变化(HE ×40) a.衰老对照组 b.衰老NS组 c.衰老AA组 d.衰老0.1%DMAE组 e.衰老0.2%DMAE组 f.衰老0.1%DMAE+AA组 g.衰老0.2%DMAE+AA组 h.正常对照组

Fig1 Histological changes in each group (HE ×40). a. aging control group. b. aging NS group. c. aging AA group. d. aging 0.1%DMAE group. e. aging 0.2%DMAE group. f. aging 0.1%DMAE+AA group. g. aging 0.2%DMAE+AA group. h. normal control group.

表2 各组真皮厚度、Hyp含量以及MMP-1、TIMP-1mRNA、PCNA的表达情况

本研究结果表明，D半乳糖诱导的衰老对照组大鼠皮肤真皮厚度、Hyp的含量、成纤维细胞PCNA的表达、MMP-1、TIMP-1mRNA的表达均显著低于正常大鼠，在组织学、细胞增殖和胶原代谢方面均呈现老化的特征，说明本研究应用D半乳糖125 mg/kg.d在大鼠颈背部皮下注射连续42 d，大鼠皮肤亚急性化学性衰老模型造模成功。

MMP-1(基质金属蛋白酶)在正常休眠组织中表达水平极低，主要在组织生长、创伤愈合、修复、重构期间表达增加。TIMP(基质金属蛋白酶抑制剂)是MMP的天然抑制物[11]。本研究结果显示，真皮内注射0.1%DMAE+AA和0.2%DMAE+AA能显著上调衰老大鼠皮肤中的MMP-1 mRNA表达水平，显著提高衰老皮肤中Hyp的含量，增加真皮厚度，其中0.2%DMAE+AA复合溶液的作用更为显著，而这两组TIMP-1 mRNA的表达水平显著低于正常对照组，提示这两组药物可促进衰老皮肤中胶原的分解代谢，使老化、变性胶原降解，修复、重新构建衰老皮肤的结构，并同时使其胶原蛋白含量增加，接近或达到正常健康大鼠生长水平。组织学上表现为衰老的大鼠真皮厚度增加，胶原纤维丰富，排列致密，呈波纹状，具有恢复皮肤年轻状态的组织结构特点。说明这两组复合药物具有延缓皮肤老化的作用。PCNA在细胞增殖的启动上发挥重要作用，可作为判断细胞增殖状态的一个指标[12]。本研究发现，衰老各治疗组成纤维细胞PCNA的表达，与衰老对照组无显著差别，提示真皮内注射上述各组药物无诱导衰老大鼠皮肤成纤维细胞增殖的作用，无细胞过度增殖产生变异和癌变的隐患。

采用相同的方法，单独在衰老大鼠真皮内注射0.2%DMAE、0.1%DMAE、AA、NS，无论是组织学表现、真皮厚度，还是Hyp含量以及MMP-1mRNA表达水平，与衰老空白组的差异均无统计学意义，但均明显低于正常对照组和0.2%DMAE+AA组、0.1%DMAE+AA组。说明单用DMAE和AA无效，只有两者结合，才具有延缓皮肤衰老的功效。

本研究依据Mesotherapy的治疗理念，在皮肤内定位、定量注射抗衰老药物，改善皮肤胶原代谢，并不影响全身其他器官。而且，无需全身用药，一方面可减少药物的用量及其相应的不良反应，降低治疗成本;另一方面可将药物直接运输至靶器官，使其疗效更加直接、显著。目前，DMAE均为外用产品，已经具有稳定可靠的疗效，如果结合Mesotherapy的独特优势，将会具有更加直接、有效的抗衰老疗效，但其深入的作用机制还有待于更深层次的研究。

[1] 姜国良, 于 晓, 徐 恺, 等. 腹腔和皮下注射D-半乳糖衰老大鼠模型分析[J]. 中国老年学杂志, 2013,33(5):1101-1103.

[2] Savoia A, Landi S, Baldi A. A new minimally invasive mesotherapy technique for facial rejuvenation[J]. Dermatol Ther (Heidelb), 2013,3(1):83-93.

[3] 高景恒, 白伶珉, 王忠媛, 等. Mesotherapy----中胚层疗法的药物应用进展(Ⅱ)[J]. 中国美容整形外杂志, 2007,18(3):213-216.

[4] 高景恒, 王志军, 张 晨. Mesotherapy----中胚层疗法的药物配方(Ⅲ)[J]. 中国美容整形外科杂志, 2007,18(4):294-297.

[5] Atiyeh BS, Ibrahim AE, Dibo SA. Cosmetic mesotherapy: between scientific evidence, science fiction, and lucrative business[J]. Aesthetic Plast Surg, 2008,32(6):842-849.

[6] El-Domyati M, El-Ammawi TS, Moawad O, et al. Efficacy of mesotherapy in facial rejuvenation: a histological and immunohistochemical evaluation[J]. Int J Dermatol, 2012,51(8):913-919.

[7] Grossman RM, Gisoldi EM, Cole C. Long-term safety and efficacy evaluation of a new skin firming technology: dimethylethanol[C]. New Orleans: 60th Annual Meeting of the Academy of Dermatology, 2002:22.

[8] Sommerfeld B. Randomised, placebo-controlled, double-blind, split-face study on the clinical efficacy of Tricutans on skin firmness[J]. Phytomedicine, 2007,14(11):711-715.

[9] Morissette G, Germain L, Marceau F. The antiwrinkle effect of topical concentrated 2-dimethylaminoethanol involves a vacuolar cytopathology[J]. Br J Dermatol, 2007,156(3):433-439.

[10] Gragnani A, Giannoccaro FB, Sobral CS, et al. Dimethylaminoethanol affects the viability of human cultured fibroblasts[J]. Aesthetic Plast Surg, 2007,31(6):711-718.

[11] 刘月恒, 来吉祥, 董银卯, 等. 基质金属蛋白酶-1与皮肤衰老的研究进展[J]. 中国老年学杂志, 2010,30(20):3037-3039.

[12] 王 琦, 王润和, 胡 强, 等. PCNA和CD44v6在皮肤鳞状细胞癌和基底细胞癌中表达的研究[J]. 中国美容医学, 2010,19(10):1487-1489.

EffectofdimethylaminoethanoandcompoundaminoacidonMMP-1andTIMP-1mRNAexpressionofratagingskin

LIUSu,FANYa-hong,ZHAOCai-ling,etal.

(DepartmentofPlasticSurgery,ZhujiangHospital,SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510280,China)

ObjectiveTo study the effect of dimethylaminoethano and compound amino acid on MMP-1 and TIMP-1 mRNA expression of rat aging skin induced by D-galactose.MethodsEighty wistar rats were randomly divided into the normal control group, the aging control group and the experimental groups. At 18 days after D-gal induction, the experimental groups were treated with intradermal microinjection of 0.2%DMAE+AA、0.1%DMAE+AA、0.2%DMAE、0.1%DMAE、AA and normal saline (NS) on bilateral buttocks respectively, once a week for 4 weeks. At 42 days after treatment, the histological changes, the dermal thickness, hydroxyproline (Hyp) and mRNA expression of MMP-1， TIMP-1 and PCNA in every group were detected.ResultsMesotherapy with intradermal co-injection of 0.1%DMAE+AA, or 0.2%DMAE+AA significantly increased the dermal thickness, Hydroxyproline content and MMP-1 mRNA expression levels, but did not affect the expression of TIMP-1 mRNA and PCNA in aging rats.ConclusionLocal co-injection of DMAE and compound AA directly into target tissue under mesotherapy has marked anti-aging effects on D-galactose induced skin aging model of rat by degradation of aging collagen fiber and reconstruction of skin structure.

Dimethylaminoethanol; Compound Amino acid; MMP-1; TIMP-1; Mesotherapy

10.3969/j.issn.1673-7040.2014.06.022

R965

A

1673-7040(2014)06-0381-04

2014-03-31)

510280 广东 广州，南方医科大学珠江医院 整形外科(刘 肃，柳大烈)；张家口市第二医院 检验科(樊亚红)；青岛大学医学院附属医院 整形美容科(刘 肃，赵彩玲，陈振雨)

刘 肃(1970-)，女，辽宁沈阳人，副教授，硕士.

柳大烈，510280，南方医科大学珠江医院 整形外科，电子信箱：liudalie@hotmail.com