糖尿病大鼠血糖波动下SOD、MDA、NO变化及丹蛭降糖胶囊的干预作用

吴元洁，郑书国，方朝晖，吴元波，吴传云，王玉凤，刘晓丽，张晓军

(1.安徽中医药大学，安徽合肥 230038;2.皖南医学院，安徽芜湖 241002;3.安徽中医药大学第一附属医院，安徽合肥 230031;4.安徽医科大学附属省立医院，安徽合肥 230001)

近年来，血糖波动已日益成为糖尿病及其慢性并发症研究的新热点，研究表明糖尿病慢性并发症的发生发展与血糖波动密切关联，血糖波动是氧化应激的可能参与机制［1-2］。中药复方以其整体调治，疗效稳定，副作用小的优势，在糖尿病防治上的作用日趋受到重视，临床研究发现益气养阴活血中药丹蛭降糖胶囊对糖尿病有良好的疗效［3］，该药是否对血糖波动存在影响尚值得进一步研究。本实验拟从超氧化物歧化酶 (SOD)、丙二醛(MDA)、一氧化氮 (NO)等指标探讨丹蛭降糖胶囊对波动血糖的影响，为糖尿病波动血糖的防治研究提供一定的实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 Sprague-Dawley雄性大鼠120只，体质量 (180±20)g，由安徽省实验动物中心提供，动物质量合格证号:scxk(皖)2011-002。实验过程中对动物处置符合动物伦理学要求。

1.2 药物与试剂 丹蛭降糖胶囊由太子参、生地黄、牡丹皮、菟丝子、泽泻、水蛭等药物组成，是安徽中医药大学第一附属医院院内制剂 (皖药制字Z20050066)，批号为20061215，为该院制剂中心按照成熟的水提工艺生产，检测标准为以HPLC法测定丹皮酚和芍药苷，每1粒胶囊中两成分的量分别不低于1.0 mg和0.1 mg;临用时以蒸馏水加适量CMC-Na配置成一定质量浓度。每粒相当于生药0.5 g，成人用量6 g/d;链脲佐菌素 (streptozotocin，STZ)购自美国Sigma公司，4℃保存，新鲜配制使用;柠檬酸及柠檬酸钠购自天津市津宏化工有限公司;血糖仪及同批号血糖试纸购自德国贝朗公司;普通胰岛素购自江苏万邦生化医药公司;125I胰岛素放免试剂盒购自中国原子能科学研究院同位素研究所;超氧化物歧化酶、丙二醛、一氧化氮、蛋白定量试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

1.3 糖尿病大鼠血糖波动模型的建立方法 大鼠自由饮水，在22℃，相对湿度50%的饲养环境中适应性喂养1周。随机取15只作为正常组，其余大鼠禁食12 h后，用柠檬酸缓冲液 (0.1 mmol/L，pH 4.4)溶解配制成含1%STZ溶液，以50 mg/kg STZ腹腔注射诱发糖尿病。注射STZ 72 h取大鼠尾静脉血，用血糖仪测定随机血糖值 (最大血糖值为33.3 mmol/L，更高的血糖值仪器显示为High，按33.3 mmol/L计算)，造模10 d血糖稳定后，随机血糖水平≥16.7 mmol/L为造模成功的大鼠，作为糖尿病模型大鼠。造模成功率约80%。取糖尿病模型大鼠80只，按血糖分层随机分为持续高血糖组、波动血糖组、波动血糖+中药高剂量组、波动血糖+中药低剂量组，每组20只，波动血糖模型及用药组大鼠每周检测2次8∶00和18∶00的血糖值，并根据这两个时间点的血糖水平，每日于8∶00和18∶00根据血糖情况分别皮下注射普通胰岛素或灌胃葡萄糖，即当血糖值≥16.7 mmol/L时皮下注射1～3 U普通胰岛素，当血糖值＜16.7 mmol/L时，则灌胃葡萄糖2 g/kg体质量，造成1日内大鼠血糖浓度大幅波动模型。正常组和持续高血糖组大鼠以相同给药方式给予同体积生理盐水。共6周。

1.4 给药方法 波动血糖+中药高剂量组、波动血糖+中药低剂量组大鼠按人与大鼠单位体质量折算系数 (以大鼠200 g与人70 kg比较，折算系数为0.018)，给予丹蛭降糖胶囊灌胃，以体质量60 kg成人用量6 g/d计算，则波动血糖+中药高剂量组、波动血糖+中药低剂量组大鼠分别予以丹蛭降糖胶囊0.63 g/(kg·d)、1.26 g/(kg·d)灌胃，其他3组灌胃等体积生理盐水。给药6周。

1.5 标本采集 实验末次给药后禁食12 h，各组大鼠按40 mg/kg体质量以1%戊巴比妥钠溶液行腹腔注射麻醉，腹主动脉抽血，离心取血清保存;处死大鼠后切取部分胰尾组织，以10%中性甲醛液固定，行HE检测;取0.4 g胰腺组织制备成10%匀浆，离心取上清液保存。

1.6 观察指标及检测方法

1.6.1 一般情况观察 观察各组大鼠精神状态，毛色，体质量，进食，尿量等。

1.6.2 各组大鼠1日5次血糖水平及血糖稳定性每周1次，测1 d内8∶00、10∶00、16∶00、18∶00、20∶00血糖水平，并描绘血糖波动6周后各组大鼠1 d内8∶00、10∶00、16∶00、18∶00、20∶00血糖变化趋势曲线。用血糖日平均水平(MBG)、日平均血糖的标准差 (SDBG)、最大血糖波动幅度 (LAGE，日内血糖最高值与最低值之差)量化血糖稳定性，计算血糖波动6周后各组大鼠MBG、SDBG、LAGE值。

1.6.3 血清及胰腺组织SOD、MDA、NO检测以酶标仪测定血清和胰腺SOD、MDA、NO。匀浆蛋白浓度采用微量双缩脲法，MDA采用TBA比色法，SOD采用黄嘌呤氧化酶法，NO采用硝酸还原酶法测定。

1.6.4 空腹血清胰岛素 (FINS) 采用放免法测定。

1.6.5 胰腺形态学变化 胰尾组织经10%中性甲醛液固定后常规石蜡包埋，4 μm切片，行HE染色。光镜下观察胰腺形态学变化。

1.7 统计学分析 采用SPSS 20.0软件进行统计。数据行正态分布检验，符合正态分布用单因素多水平设计定量资料的方差分析，并进行方差齐性分析，方差齐用LSD检验，方差不齐用Tamhane's T2检验，数据以表示;非正态分布进行多个独立样本非参数检验，数据以中位数 (M)与四分位间距 (Q)表示;大鼠1日血糖变化用两因素重复测量设计定量资料的方差分析。相关分析采用Pearson相关分析。各种检验的显著性水平设定为P ＜0.05。

2 结果

2.1 一般情况 造模后持续高血糖组大鼠精神萎靡，行动迟缓，对外界反应迟钝，毛色无光泽，易脏，进食减少，饮水量、尿量增加，尿液腥臊味加重，多数大鼠体质量明显降低，部分大鼠尿路感染，皮肤出现溃烂、脓肿，波动血糖组较持续高血糖组症状更明显，部分大鼠出现白内障表现。波动血糖+中药高剂量组、波动血糖+中药低剂量组大鼠较两模型组精神明显好转，活动力较强，反应较灵敏，毛色较光泽，尿液腥臊味减轻，体质量较两模型组亦明显增加。波动6周后，正常组、持续高血糖组、波动血糖组、波动血糖+中药高剂量组、波动血糖+中药低剂量组大鼠因感染、严重并发症、灌胃操作不当等原因分别死亡2只、7只、7只、6只、7只。

2.2 血糖波动6周后各组大鼠1日5点时间血糖变化及血糖日平均水平、日平均血糖的标准差、最大血糖波动幅度 见图1、表1。图1可看出，波动血糖组大鼠血糖在8∶00较高，然后呈下降趋势至10∶00血糖降至最低，之后血糖持续上升至18∶00达高峰，然后下降。在1日内形成2个明显的血糖波动高峰和低谷;两用药组大鼠血糖波动趋势基本和波动血糖组一致，但血糖变化趋势相对平缓;持续高血糖组血糖变化趋势较波动血糖组亦相对平缓，在8∶00最高，然后下降，至10∶00血糖降至最低，之后持续呈上升趋势至20∶00达最高。正常组血糖1日内血糖变化幅度最小，基本保持稳定低值。单因素多水平方差分析显示:与正常组比较，其他4组MBG、SDBG、LAGE明显升高，差异有统计学意义 (P＜0.01);与持续高血糖组比较，波动血糖组大鼠SDBG、LAGE明显增高，MBG降低，差异有统计学意义 (P＜0.01);两用药组MBG、SDBG、LAGE与波动血糖组比较均有减少的趋势，但差异无统计学意义。

图1 血糖波动6周后各组大鼠1日5点血糖变化趋势Fig.1 Intraday variation of blood glucose in diabetic rats

表1 血糖波动6周后各组大鼠血糖日平均水平、日平均血糖标准差、最大血糖波动幅度变化 ()Tab.1 Changes in MBG，SDBG and LAGE in rats after blood glucose fluctuation for 6 weeks()

表1 血糖波动6周后各组大鼠血糖日平均水平、日平均血糖标准差、最大血糖波动幅度变化 ()Tab.1 Changes in MBG，SDBG and LAGE in rats after blood glucose fluctuation for 6 weeks()

注:与正常组比较，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;与持续高血糖组比较，△P ＜0.05，△△P ＜0.01

组别 动物数 血糖日平均水平/(mmol·L-1) 日平均血糖标准差/(mmol·L-1)最大血糖波动幅度/(mmol·L-1)13 5.77±0.21 0.41±0.13 0.50±0.28持续高血糖组 13 29.83±1.97＊＊ 2.58±0.85＊＊ 5.29±2.24＊＊波动血糖组 13 22.31±5.97＊＊△△ 8.86±1.63＊＊△△ 16.22±5.14＊＊△△波动血糖+中药高剂量组 14 21.38±4.05＊＊△△ 7.10±2.02＊＊△△ 9.61±4.60＊＊波动血糖+中药低剂量组 13 21.74±4.01＊＊ 8.09±1.38＊＊△△ 10.89±4.56正常组＊＊△△

2.3 血糖波动6周后各组大鼠空腹血清胰岛素水平 见表2。经多个独立样本比较的Kruskal-Wallis H检验，血糖波动6周后5组大鼠FINS水平χ2=14.179，P=0.007，FINS水平总体分布存在显著性差异，其中正常组大鼠FINS水平最高 (平均秩45.50)，波动血糖组大鼠FINS水平最低 (平均秩19.13)。持续高血糖组、波动血糖组、波动血糖+中药低剂组与正常组FINS水平差异有统计学意义 (P＜0.05，P＜0.01);波动血糖+中药高剂组FINS与波动血糖组相比，差异有统计学意义(P＜0.05);波动血糖组与持续高血糖组FINS水平比较，差异则无统计学意义 (P＞0.05)。

表2 血糖波动6周后各组大鼠空腹血清胰岛素水平Tab.2 Levels of FINS in rats after blood glucose fluctuation for 6 weeks

2.4 各组大鼠氧化应激相关指标变化比较 见表3。单因素多水平方差分析显示:与正常组比较，持续高血糖组、波动血糖组大鼠血清SOD、胰腺SOD水平明显降低，血清MDA、胰腺MDA水平明显升高 (P＜0.01);持续高血糖组血清NO水平明显升高 (P＜0.05)，持续高血糖组、波动血糖组胰腺NO水平明显升高 (P＜0.05，P＜0.01)。与波动血糖组比较，波动血糖+中药高剂量组、波动血糖+中药低剂量组血清SOD水平明显升高(P＜0.01);而中药两组血清MDA、NO以及胰腺MDA、NO水平较波动血糖组有降低趋势，胰腺SOD水平有上升趋势，其中，波动血糖+中药低剂量组血清MDA和胰腺SOD与波动血糖组之间差异有统计学意义 (P＜0.05)。

表3 各组大鼠血清及胰腺SOD、MDA、NO比较 ()Tab.3 Levels of SOD，MDA，NO in serum and pancreatic tissue of rats()

表3 各组大鼠血清及胰腺SOD、MDA、NO比较 ()Tab.3 Levels of SOD，MDA，NO in serum and pancreatic tissue of rats()

注:与正常组比较，*P ＜0.05，＊＊P＜0.01;与波动血糖组比较，▲P ＜0.05，▲▲P ＜0.01

组别 动物数 血清SOD/(U·mL-1)血清MDA/(nmol·mL-1)血清NO/(μmol·L-1)胰腺SOD/(U·mgprot-1)胰腺MDA/(nmol·mgprot-1)胰腺NO/(μmol·mgprot-1)正常组 13 239.73±15.56 2.28±0.56 1.48±0.24 10.16±2.21 1.40±0.56 2.79±1.05持续高血糖组 13 196.98±21.37＊＊ 3.35±1.06＊＊2.26±0.42* 7.35±1.47＊＊ 2.06±0.49＊＊ 5.50±2.69*波动血糖组 13 194.88±17.66＊＊ 3.38±0.94＊＊1.81±0.32 8.42±1.49＊＊ 2.36±0.88＊＊ 6.24±2.71＊＊波动血糖+中药高剂量组 14 217.63±26.75＊＊▲▲ 2.73±1.27 1.72±0.25 8.55±1.51* 1.62±0.89 3.60±2.39波动血糖+中药低剂量组 13 228.53±20.358▲▲ 2.55±0.97▲ 1.62±0.30 9.29±3.00▲1.65±0.81 3.81±1.73

2.5 相关性分析 Pearson相关分析显示血清SOD与血清NO(r=-0.317，P＜0.05)、胰腺NO(r=-0.408，P＜0.01)呈负相关，血清MDA与血清NO呈正相关 (r=0.330，P＜0.01)，胰腺MDA与胰腺NO呈正相关 (r=0.574，P＜0.01);SDBG与FINS呈负相关 (r=-0.328，P＜0.01)，SDBG与胰腺NO呈正相关 (r=0.250，P＜0.05)，LAGE与FINS负相关 (r=-0.303，P＜0.05)。

2.6 各组大鼠胰岛组织形态学变化 见图2。正常组大鼠胰岛形态规则呈圆形，数量较多，细胞核呈圆形蓝色着染，胞质丰富浅粉色着染;持续高血糖组和波动血糖组大鼠均可见胰岛萎缩，β细胞数量减少，颗粒脱失，空泡变性，部分β细胞体积代偿性增大等，波动血糖组病理表现尤为严重;波动血糖+中药高剂量组、波动血糖+中药低剂量组大鼠仍有部分β细胞体积代偿性增大，但较持续高血糖组和波动血糖组胰岛明显增大，形状较规则。

3 讨论

图2 各组大鼠胰岛组织形态学变化 (HE×400)Fig.2 Morphologic variations of rat pancreatics islets(HE×400)

与糖调节正常人群相比，糖尿病患者由于胰岛β细胞功能缺陷、胰岛素抵抗等因素，导致血糖调节机制障碍，从而引起持续性或间歇性的血糖波动。本研究在腹腔注射链脲佐菌素建立糖尿病持续高血糖模型的基础上，通过每日2次皮下注射普通胰岛素或灌服葡萄糖诱导糖尿病血糖波动模型，采用MBG、SDBG、LAGE等量化指标评价血糖的稳定性。实验发现糖尿病持续高血糖模型和血糖波动模型组大鼠MBG、SDBG、LAGE较正常组明显增高 (P＜0.05，P＜0.01)，而血糖波动模型组SDBG、LAGE显著高于持续高血糖模型组 (P＜0.01)，说明糖尿病波动血糖模型成功，同时也反映了糖尿病高血糖状态较糖调节正常状态而言，本身也存在着一定的血糖波动。

血糖波动状态较持续性高糖更能诱导胰岛和INS-1细胞分泌胰岛素功能损伤。Guerra等［4］体外实验研究发现，与正常血糖 (5.5 mmol/L)培养的人胰岛β细胞相比，波动葡萄糖刺激处理 (5.5与16.7 mmol/L隔日交替)的β细胞胰岛素释放功能受损，细胞凋亡增加;体内实验研究［5］亦证实波动性高血糖较持续性高血糖更能抑制GK大鼠胰岛素释放功能和胰岛素相关基因表达，对β细胞损害更为明显。本实验发现血糖波动6周后持续高血糖组和血糖波动组SD大鼠FINS水平明显低于正常组 (P＜0.05，P＜0.01)，其中血糖波动组FINS水平最低;大鼠胰岛组织形态学显示糖尿病模型组大鼠胰岛萎缩，β细胞数量减少，部分β细胞体积代偿性增大，细胞凋亡，以血糖波动模型组病理表现尤为严重。相关分析显示SDBG、LAGE与FINS呈负相关。提示血糖波动与胰岛素相关，且较持续高血糖对胰岛素的损伤更加严重。

活性氧簇 (ROS)如超氧阴离子和过氧化氢和活性氮基团 (RNS)如一氧化氮、过氧亚硝酸盐的生理信号功能的紊乱被认为是糖尿病的重要特征［6］。有研究表明血糖波动易引发氧化应激，Stadler等［7］研究认为氧化应激是糖尿病慢性并发症的主要发病机制之一。Monnier等［8］发现尿中8-iso-PGF(2α)排出率与血糖波动强度呈高度正相关。氧化应激状态下产生了过量的ROS，引起DNA、蛋白质、脂质氧化的损伤，胰岛β细胞由于氧自由基清除酶水平很低而最易被损伤。Bian等［9］通过多元线性逐步回归分析发现住院糖尿病患者平均血糖波动幅度 (MAGE)是精氨酸刺激试验C肽增值 (ACP)的独立影响因素，认为血糖波动对胰岛β细胞功能的损伤较持续性的高血糖更严重。另外，活性氧 (ROS)与NO关系亦较密切。NO是由L-精氨酸在一氧化氮合成酶 (NOS)催化下合成的。一经产生，NO即能迅速与超氧阴离子()产生强大的有毒氧化剂过氧化亚硝酸盐(ONOO-)，由于NO与超氧阴离子反应形成ONOO-的速度比铜/锌超氧化物歧化酶与超氧阴离子的反应速度快6倍［10］，且胰岛β细胞本身的氧自由基清除酶水平很低，所以过氧化亚硝酸盐对线粒体功能和DNA合成造成严重的毒性作用，不仅能直接氧化和损伤胰岛细胞DNA、蛋白质、脂质，还可能影响蛋白激酶C和B，磷脂酰肌醇3'-激酶，细胞外信号调节激酶催化的酶/基因调控的细胞内信号传导，导致胰岛素基因表达障碍［7］。有实验通过外源性的一氧化氮对大鼠胰岛细胞、肝细胞、居民活化的巨噬细胞、主动脉内皮细胞和小鼠肿瘤细胞系等不同细胞的毒性作用比较，证实胰岛细胞是上述细胞中对NO最敏感的细胞，推断NO可在胰岛炎导致的胰岛素依赖型糖尿病中发挥着重要作用［11］。本实验发现糖尿病大鼠较正常组血清和胰腺SOD水平明显降低，MDA水平明显升高 (P＜0.01);MDA为脂质过氧化产物的标志，SOD是评价抗氧化能力的经典指标，SOD水平明显降低，MDA水平明显升高说明糖尿病持续高血糖和波动血糖状态下均存在明显的氧化应激。实验亦发现持续高血糖组血清和胰腺NO水平明显升高，波动血糖组胰腺 NO水平明显升高 (P＜0.05，P＜0.01)，相关分析显示血清SOD与血清NO以及胰腺NO均呈负相关;血清MDA与血清NO呈正相关;胰腺MDA与胰腺NO呈正相关。说明糖尿病持续高血糖和波动血糖状态下抗氧化能力减低以及脂质过氧化产物的增加均与NO有关。

糖尿病病机复杂，中医整体观念的认识观符合糖尿病的诊治模式。糖尿病属于中医“消渴”范畴，以“气虚阴亏血瘀”为基本病机，丹蛭降糖胶囊以太子参补益脾肾之气，生地黄滋养脾肾之阴，菟丝子补肾固精;丹皮、水蛭行气化瘀通络;泽泻清热泻浊。共奏益气养阴，活血化瘀之功，在改善糖尿病症状、胰岛细胞功能及氧化应激等方面有良好作用［12-14］。为研究其对糖尿病血糖波动大鼠的影响，本实验对糖尿病血糖波动大鼠进行了6周的丹蛭降糖胶囊治疗，发现中药高低剂量组的大鼠胰岛较两组模型组明显增大，血清胰岛素水平高于血糖波动组，其中，与波动血糖组比较，中药高剂量组提高FINS水平显著 (P＜0.05);中药高低剂量组血清SOD水平明显升高 (P＜0.01)，中药低剂量组血清MDA水平明显减低，胰腺SOD水平明显升高 (P＜0.05);此外，中药高低剂量组MBG、SDBG、LAGE以及血清 NO和胰腺 MDA、NO水平较血糖波动组均有降低趋势，但差异无统计学意义 (P＞0.05)。说明丹蛭降糖胶囊能够提高胰岛β细胞数量，促进其再生而提高胰岛素水平，从而改善糖尿病症状，并能有效抑制糖尿病波动血糖状态下的氧化应激，其作用主要在抗氧化方面。由于糖尿病波动血糖的影响因素和机制复杂，因此，关于丹蛭降糖胶囊影响β细胞分泌的机制及抗氧化机制尚有待进一步深入研究。

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