冠心平对ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化氧化与抗氧化指标的影响

戴海云，李七一，严士海

(1.南京中医药大学，江苏南京 210000;2.江苏省中医院，江苏南京 210029)

动脉粥样硬化 (Atherosclerosis，AS)导致的心肌梗死、脑梗死以及冠心病等心脑血管疾病，在目前人类病死原因中占首位。机体过氧化损伤是动脉粥样硬化发生发展的重要因素之一。南京中医药大学附属江苏省中医院李七一教授临床采用益气养阴、活血化痰法治疗冠心病心绞痛收到较好效果［1］。此后根据益气养阴、活血化痰法自拟了冠心平方应用于临床。在前期临床及实验研究中提示冠心平能调节血脂水平、保护血管内皮、改善心肌缺血，体外实验证明冠心平含药血清能减少细胞上清液中ET、MDA的水平，增加超氧化物歧化酶 (SOD)与一氧化氮合酶 (NOS)的活性，减低细胞凋亡率，减轻细胞线粒体膜电位的增加，降低NF-κB的表达增加［2］。本实验在前期研究基础上，观察了冠心平对ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化模型血清氧化应激与抗氧化指标超氧化物歧化酶 (SOD)、总抗氧化能力 (AOC)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽 (GSH)、氧化低密度脂蛋白 (ox-LDL)水平的影响，以进一步探讨该方作用机制。

1 材料和方法

1.1 药品和试剂 冠心平，由江苏省中医院药剂科制备(批号110802);阿托伐他汀钙片，由辉瑞制药有限公司提供 (批号:084311K);苯磺酸氨氯地平，由辉瑞制药有限公司提供 (批号1105113)。血清T-SOD测定试剂盒，由南京建成生物工程研究所提供 (批号20120530);血清GSH测定试剂盒，由南京建成生物工程研究所提供 (批号20120611);血清测定MDA试剂盒，由南京建成生物工程研究所提供 (批号20120529);血清T-AOC测定试剂盒，由南京建成生物工程研究所提供 (批号20120607)。

1.2 实验动物 ApoE-/-小鼠，体质量 (20±2)g，雄性，由北京大学医学部实验动物科学部提供，合格证号:SCXK(京)2006-0008。

1.3 分组 小鼠适应性饲养后，称定质量，根据体质量随机分组编号。将60只ApoE-/-小鼠随机分成6组，每组10只，分别为空白组 (普通饲料)、模型组 (高脂饲料)、阿托伐他汀组 (6.67 mg/kg)、苯磺酸氨氯地平组 (1.67 mg/kg)、冠心平低剂量组 (0.75 g/kg)、冠心平高剂量组(1.5 g/kg)。各剂量组采用高脂饲料+药物干预模式。

1.4 动物模型的建立 购买ApoE-/-小鼠，高脂饲料配料(78%基础饲料、2%胆固醇、10%蛋黄粉、10%猪油配制)喂养12周，采血并做病理以确定模型成功。

1.5 实验方法 正常组为基础饲料喂养，其余组为高脂饲料饲养。除正常组与模型组外，冠心平低剂量组、冠心平高剂量组、阿托伐他汀组、苯磺酸氨氯地平组均高脂饲料喂养12周后，给予相应的药物，正常对照组、模型组则于12周后给予等量蒸馏水灌胃。冠心平高低剂量组与阿托伐他汀组、苯磺酸氨氯地平组分别将药物溶解于蒸馏水中灌胃，灌胃容积量按0.1 mL/10 g计算，每日1次，共1周。每周称体质量1次，记录体质量，末次给药1 h后，眼眶采血，检测相应指标。处死动物，取主动脉血管，液氮保存，备检测。

1.6 观测指标及测定方法

1.6.1 分光光度法与elisa法检测血清中氧化性指标MDA等，抗氧化性指标SOD、AOC、GSH的水平，具体根据试剂说明书操作。

1.6.2 ox-LDL的检测 提取血管组织蛋白，蛋白样品处理后进行电泳，转膜，染色，封闭，一抗二抗孵育，加发光液，曝光。保存显示有目的条带的胶片，以β-actin为内参照，应用图象分析仪对条带做扫描半定量。

1.7 数据统计 应用SPSS 15.0软件包，资料数据均用均数±标准差 ()表示，数据先进行方差齐性检验，组间比较用单因素方差分析，P＜0.05为差异有显著性意义，P＜0.01为差异有非常显著性意义;定量分析主动脉粥样硬化斑块面积，使用的Image-Pro Plus软件4.5(Media Cybernetics公司)。

2 实验结果

2.1 冠心平对模型 3个月小鼠血清 T-SOD、T-AOC、MDA、GSH的影响 模型组小鼠血清 T-SOD、T-AOC、GSH的水平明显降低，与正常组比较具有显著性差异(P﹤0.01)。模型组小鼠血清MDA、ox-LDL的水平明显升高，与正常组比较具有显著性差异 (P﹤0.01)。冠心平低剂量与高剂量组小鼠血清T-SOD、T-AOC、GSH的水平比模型组明显升高，与模型组比较具有显著性差异 (P﹤0.05，P﹤0.01)。冠心平低剂量与高剂量组大鼠血清MDA、ox-LDL的水平比模型组明显降低，与模型组比较具有显著性差异 (P﹤0.01)。提示:冠心平具有升高ApoE-/-小鼠血清T-SOD、T-AOC、GSH的水平，降低血清MDA、ox-LDL水平的作用。见表1～2。

表1 各组3个月小鼠血清T-SOD、T-AOC、MDA、GSH的水平 (，n=10)

表1 各组3个月小鼠血清T-SOD、T-AOC、MDA、GSH的水平 (，n=10)

注:与正常组比较，△△P﹤0.01;与模型组比较，*P﹤0.05，＊＊P﹤0.01

组 别 T-SOD/(U·mL－1) T-AOC/(U·mL－1) MDA/(nmol·mL－1) GSH/(mg·L－1)96.68±4.58 2.89±0.6 22.64±5.04 13.28±5.82模型对照组 85.71±18.48△△ 1.54±0.59△△ 33.09±3.93△△ 5.09±2.07△△阿托伐他汀组 95.35±4.42* 2.21±0.58* 25±4.97＊＊ 10.73±4.08＊＊氨氯地平组 95.56±6.64＊＊ 2.31±0.56＊＊ 23.36±5.05＊＊ 12.06±4.63＊＊冠心平低剂量组 94.1 ±2.41＊＊ 2.09±0.56* 24.27±5.42＊＊ 10.34±4.16＊＊冠心平高剂量组 95.44±4.18＊＊ 2.52±0.76＊＊ 22.09±5.72＊＊ 11.95±5.27正常对照组＊＊

表2 各组3个月小鼠血清ox-LDL的水平 (，n=8)

表2 各组3个月小鼠血清ox-LDL的水平 (，n=8)

注:与正常组比较，△△P﹤0.01;与模型组比较，＊＊P﹤0.01

组 别 剂量/(g·kg－1) ox-LDL(μg/mL)1.24±0.44模型对照组 等量生理盐水 5.71±1.27△△阿托伐他汀组 6.67×10－3 3.19±1.19＊＊氨氯地平组 1.67×10－3 4.13±0.72＊＊冠心平低剂量组 0.75 5.56±0.93冠心平高剂量组 1.5 2.88±1.12正常对照组 等量生理盐水＊＊

2.2 冠心平对ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化模型主动脉病理的影响 取主动脉血管用10%中性甲醛固定，石蜡包埋用于常规病理检查。HE染色，见图1～2。

HE染色显示，正常组血管壁内膜清晰，无斑块;模型组斑块严重;冠心平组结果与阿托伐他汀组、氨氯地平组的斑块明显变小。

3 讨论

动脉粥样硬化 (Atherosclerosis，AS)导致的心肌梗死、脑梗死以及冠心病等心脑血管疾病，在目前人类病死原因中占首位。机体过氧化损伤是动脉粥样硬化发生发展的重要因素之一。正常情况下，随着氧化代谢效率的提高，体内的抗氧化能力也不断增强，人体已经形成较为完善的抗氧化体系，即机体和细胞内活性氧的生成和清除处于一种动态平衡。当在某些因素的作用下这种平衡被打破，就形成了氧化应激。活性氧在血管病变，尤其是动脉粥样硬化发生发展过程中扮演重要的角色。氧化应激主要通过调节过氧化作用、诱导血管炎症基因表达、促进局部炎症反应和细胞增殖，多方面参与动脉粥样硬化的发生发展。

图1 冠心平对ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化模型主动脉病理影响

图2 主动脉动脉粥样硬化病

人体内SOD以CuZnSOD为主，其含有量最高，是人体细胞抵御氧自由基损害的重要酶。研究证实，氧自由基介导的脂质过氧化损伤参与了动脉粥样硬化形成和发展的病理过程［3］，氧自由基不仅氧化修饰低密度脂蛋白，促进泡沫细胞形成，而且还可以破坏血管内皮细胞，导致其功能障碍，从而促进动脉粥样硬化发生。SOD是预防机体形成超氧阴离子自由基损害的主要活性酶，SOD活力增高，可对自由基清除增加，从而减轻对组织的氧化损伤和抑制LDL的氧化。血清中的T-AOC主要是血清中非酶促体系的抗氧化物质和酶促体系少数小分子量抗氧化物质的总和，是反映机体抗氧化作用的重要指标之一［4］。研究发现MDA、T-AOC是自由基损伤和酶促、非酶促系统清除氧自由基作用的敏感指标［5］。GSH是广泛存在于生物体内的一种生物活性肽，是细胞内重要的还原剂，对过氧化物、自由基和亲电子基起拮抗作用，能清除过氧化代谢产物，阻断脂质过氧化反应，从而起到保护细胞膜结构和功能完整的作用［6］。MDA是脂质过氧化代谢的毒性终产物，其含量直接反映体内脂质过氧化的速率和强度，并可间接反映机体清除自由基的能力，自由基作用于脂质发生过氧化反应，氧化终产物为MDA，会引起蛋白质、核酸等生命大分子的交联聚合，且具有细胞毒性［7］。ox-LDL促进动脉粥样硬化形成及进展的机制也非常复杂，例如:ox-LDL作用于血管内皮细胞，诱导其表达ox-LDL，增强其摄取ox-LDL的功能，并可诱导内皮细胞表达基质金属蛋白酶、纤溶酶原激活物抑制剂-1等炎症递质［8］。血浆中低密度脂蛋白(LDL)和自由基代谢产物丙二醛 (MDA)在过氧化作用下，形成氧化修饰的低密度脂蛋白 (OX-LDL)及MDALDL，OX-LDL和MDA-LDL目前被认为是引起细胞内脂质聚集和泡沫形成的重要因素［9-11］。

冠心平由黄精、当归、三七、瓜蒌皮、甘松组成，具有益气养阴、活血祛瘀、化痰通络、行气止痛之功效。本方源自古方当归补血汤(《兰室秘藏》)加减。方中黄精与黄芪既补中益气，又益精气，润心肺，补肝阴，为君药;当归养血活血、补中有行、补而不滞，三七活血化瘀通脉，两味共为臣药;瓜蒌皮宽胸化痰、开痹散结，为佐药;甘松理气止痛，与三七同入心经，可治“卒心腹痛满”，同为使药。全方药物性味平和，攻补兼施，标本兼顾，补而不滞，攻而不峻，药有侧重，甚切冠心病气阴两虚、痰瘀互阻之病机。前期临床研究冠心平能调节血脂水平、保护血管内皮、改善心肌缺血，体外实验证明冠心平含药血清能减少细胞上清液中ET、MDA的水平，增加超氧化物歧化酶 (SOD)与一氧化氮合酶 (NOS)的活性，减低细胞凋亡率，减轻细胞线粒体膜电位的增加，降低NF-κB的表达增加。现代药理研究发现，黄精、三七、甘松、当归均具有抗氧化作用［12-14］。

本研究通过实验证实冠心平对高脂饲料饲喂致动脉粥样硬化ApoE-/-小鼠，具有升高血清T-SOD、T-AOC、GSH的水平，和降低血清MDA、ox-LDL水平的作用，证实其确实能够有效地干预动脉粥样硬化斑块发生、发展，降低心血管疾病的发生，为冠心平治疗动脉粥样硬化提供了实验依据。

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