山银花黄酮粗提物抗氧化活性的体外观察

徐望龙，李云贵，孙林军，唐励静，谢雁飞，郭 玉*

(1.南华大学药物药理研究所，湖南衡阳 421001;2.南华大学船山学院，湖南衡阳 421001;3.娄底市中心医院，湖南娄底 417000)

山银花Lonicerae Flos为忍冬科植物灰毡毛忍冬Lonicera macrathoides Hand.-Mazz.、红腺忍冬 Lonicera hypoglauca Miq.、华南忍冬Lonicera confusa DC.或黄褐毛忍冬Lonicera fulvotomentosa Hsu et S.C.Cheng的干燥花蕾或带初开的花［1］。忍冬科植物中的黄酮类化合物种类丰富［2］，现代研究发现黄酮类化合物具有广泛的药理作用，如抗肿瘤、抗炎症、抗突变、抗过敏、降血脂等［3-4］。山银花为临床常用中药，具有清热解毒、凉散风热的功效，常用于治疗痈肿疔疮、喉痹、丹毒、热毒血痢、风热感冒、温病发热等症［5］，其黄酮化合物的抗氧化活性目前尚未见报道。本研究采用70%乙醇浸提与超声波相结合的方法提取山银花总黄酮，并采用清除O2－·、·OH和DPPH·的效果及对氧化损伤的内皮细胞和心肌细胞的保护作用，体外观察山银花中黄酮类化合物的抗氧化活性，为山银花黄酮类化合物的进一步开发利用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品 新鲜山银花采摘于湖南省邵阳市隆回县，经湖南省中医药研究院鉴定。用蒸馏水洗净置于60℃烘箱中干燥，粉碎、过40目药筛，制得山银花干粉，密封保存，备用。

1.1.2 试剂 芦丁对照品 (批号100416-201004，中国食品药品检定研究院);邻二氮菲 (分析纯，大茂化学试剂厂)，邻苯三酚 (分析纯，博迪化工股份有限公司)，H2O2(分析纯，西陇化工股份有限公司)，Tris(分析纯，Aladdin Chemistry Co.Ltd)，DPPH(Purity，TCI)，DMSO(分析纯，Amresco)，维生素 C(生物级，购于 Fluka公司);MTT(分析纯，Aladdin Chemistry Co.Ltd)，其他试剂均为分析纯。

1.1.3 仪器 UV-2540(日本岛津公司);FA224型电子天平 (上海舜宇恒平科学仪器公司);SB-5200DTDN型超声波清洗仪 (宁波新芝生物科技公司);FW100高速万能粉碎机 (天津市泰斯特仪器公司);BIO-TEK酶标仪(ELX800，美国);SHZ-DⅢ型循环水真空泵 (予华仪器有限责任公司);RE-2000A型旋转蒸发器 (予华仪器有限责任公司);Freezer Dryer(FD5-2.5，Gold SIM International Group Co.Ltd);HYQ-3110涡旋混匀器 (Crystal Industries，America)。

1.2 方法

1.2.1 黄酮粗提取物的制备 称取50.0 g山银花粉末，浸于70%乙醇溶液中，先超声 (60℃、200 W)提取5 min，再回流提取30 min，同法提取3次，合并3次提取液，减压回收乙醇，浓缩至15 mL左右时移入提前称好质量的蒸发皿中，冷冻干燥得到黄酮粗提取物，称重，计算提取率。

1.2.2 芦丁标准曲线的绘制 分别取0.2 mg/mL芦丁对照品溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL于6只25 mL量瓶中，加入5%NaNO21.0 mL，摇匀，放置6 min后加入10%Al(NO3)3溶液1.0 mL和1.0 mol/L NaOH溶液10.0 mL，混匀，用蒸馏水稀释至刻度，15 min后以第一管作空白参比，在510 nm波长处测定吸光值;以吸光值A为纵坐标、质量浓度C为横坐标绘制标准曲线［6］。

1.2.3 山银花黄酮定量测定 准确称取黄酮粗品100.0 mg，加入70%的乙醇溶液，摇匀，定容至100 mL，得到样品液。精密吸取1.0 mL样品液置于25 mL量瓶中，后续步骤同“1.2.2”项，测定吸光值;由回归方程计算粗提物中黄酮的含有量。

在轮滑运动教学中，教师应该指导学生学会正确的摔倒方式，使其在发生摔倒事件时能够将身体的损伤程度降到最低。轮滑教师要指导学生在摔倒时候应该尽量保持冷静，努力将自身的膝盖先行着地，之后是手肘，最后是手掌，以此来减少身体与地面的接触面积。在摔倒时候避免身体部位直接与地面接触而产生严重的身体损伤，在向前摔倒时应将头部向后仰，向后摔倒时应将头部向前仰，尽量避免伤害到头部。

1.3 抗氧化活性测定

1.3.1 山银花黄酮粗提物对O－2·的清除作用 取质量浓度为0、50、100、150、200、250 μg/mL黄酮粗提物溶液各2.0 mL，分别加4.5 mL Tris-HCl溶液 (0.05 mol/L，pH 8.2)和2.2 mL双蒸水，室温水浴20 min，再加邻苯三酚溶液 (3.0 mmol/L)0.3 mL，迅速混匀于420 nm处测吸光值A，每30 s测1次，以双蒸水调零，质量浓度为0管用于计算邻苯三酚溶液的自身氧化速率，计算O－2·清除能力［7］。

公式:清除率 (%)=(A0－A样)/A0×100%。

其中:A0，样品质量浓度为0管的吸光值;A样，样品管的吸光值。

1.3.2 山银花黄酮粗提物对·OH的清除作用 取2.0 mL邻二氮菲溶液 (7.5 mmol/L)和4.0 mL磷酸缓冲液 (pH 7.4)7份 (1～7号)分别加入黄酮粗提物溶液 (0、0、50、100、150、200、250 μg/mL)2.0 mL，充分摇匀后加2.0 mL硫酸亚铁(0.75 mmol/L)和2.0 mL H2O2(0.01%，其中1号0管以双蒸水代替 H2O2)，摇匀，37℃水浴60 min后536 nm检测吸光值A，并以双蒸水调零。计算·OH的清除率［7］。

公式为:清除率 (%)=(A样－A空)/(A0－A空) ×100%。

其中:A0，1号0管的吸光值;A样，样品管的吸光值;A空，2号0管的吸光值。

公式为:清除率 (%)=(A空－A样)/A空×100%。

其中:A空，质量浓度为0管的吸光值;A样，样品管的吸光值。

1.3.4 山银花黄酮粗提物对内皮细胞和心肌细胞的抗氧化保护作用 用1.0 mmol/L H2O2与内皮细胞和心肌细胞共同孵育12 h复制氧化损伤模型，以维生素C为阳性抗氧化药物，用MTT法筛选建立氧化损伤模型的H2O2最佳浓度和抗氧化损伤的维生素C最佳浓度，测定波长为490 nm。同理，用MTT法检测不同质量浓度山银花黄酮粗提物预处理30 min对内皮细胞和心肌细胞氧化损伤的保护作用［9，10］。

2 统计学处理

3 结果

3.1 芦丁标准曲线与回归方程 芦丁质量浓度C与吸光值A的关系经线性回归分析，得回归方程为A=0.2406C－0.1252，r=0.9991。说明芦丁质量浓度在8～40 μg/mL范围内线性良好。

3.2 山银花黄酮粗提物的提取率与含有量 70%乙醇浸提结合超声波法，从50.0 g山银花粉末中提取得到总黄酮粗品质量为2.8254 g，其提取率为5.65%;根据测定粗提物的吸光度值，按标准曲线法，计算得到粗提物中总黄酮的含有量为16.35%。

3.3 山银花黄酮粗提物抗氧化活性实验结果

图1 山银花黄酮粗提物对·、·OH及DPPH·的清除效果

3.3.2 山银花黄酮粗提物对内皮细胞和心肌细胞的抗氧化保护作用 内皮细胞和心肌细胞与浓度1.0 mmol/L的H2O2共同孵育12 h后，细胞的形态和活性明显变化，其存活率分别下降到49.21%和61.32%。不同质量浓度的黄酮粗提物对不同类型的细胞氧化损伤的保护作用结果见表1。中、低质量浓度对内皮细胞有较强的抗氧化保护作用，而高质量浓度黄酮保护作用不明显，推测可能高质量浓度黄酮对该细胞产生了一定的毒性。在心肌细胞中，黄酮对该细胞的抗氧化保护作用呈剂量依赖性，高质量浓度组对心肌细胞的保护效果强于中质量浓度组，且两个质量浓度都有显著的保护作用，而低质量浓度组保护作用不明显。阳性对照组维生素C对内皮细胞的抗氧化保护作用明显高于保护效果最好的中质量浓度黄酮组，而对心肌细胞的抗氧化保护作用同高质量浓度的黄酮组相当。

4 讨论

黄酮是一类多酚类化合物，多具抗氧化活性，能直接清除机体的自由基，抑制还原型辅酶Ⅱ (NADPH)氧化酶的活性，抑制活性氧 (ROS)的产生，减少氧化应激。研究表明，黄酮类化合物具有抗高血压、抗癌、明显降低心血管疾病的死亡率等［9-10］。目前，有文献报道了忍冬科金银花中黄酮类化合物的提取及抗氧化活性的研究，但是，对资源丰富的山银花黄酮类化合物抗氧化活性的研究尚未见报道。谢学明等［11］的研究证实华南忍冬的乙醇提取物对DPPH·有很强的抗氧化活性。王柳萍等［12］对广西红腺忍冬和山东忍冬的总黄酮提取物的抗氧化作用进行了研究，结果为山东忍冬的抗氧化活性比广西红腺忍冬的抗氧化活性较强，说明不同地区的忍冬科植物的总黄酮提取物的抗氧化能力也有差异。现代研究证实，忍冬科的金银花黄酮类成分具有清除人体·、抗衰老、改善血管功能和提高机体免疫力等重要作用［13］;能抑制烫伤小鼠中性粒细胞释放过氧化氢，减少中性粒细胞合成和释放溶酶体酶［14］，对油脂的过氧化反应也有明显的抑制作用。

表1 山银花黄酮粗提物对内皮细胞和心肌细胞的影响 (n=6)

山银花也属忍冬科植物，与金银花极为相似，原材料来源却极为广泛。本实验以70%乙醇结合超声波法提取山银花总黄酮的操作程序简单、方便、安全，提取效率高以及提取物保留着较高的生物学活性等优点。本实验观察到山银花黄酮具有较强的清除自由基能力，并且对氧化损伤的内皮细胞和心肌细胞具有较好的抗氧化保护作用。自由基的性质活泼，氧化能力强，极易攻击生物膜中的不饱和脂肪酸，并引发脂自由基过氧化链式反应，从而导致细胞结构和功能受到不可逆性损伤，这可能是诱发多种疾病的发病机制［13，15］。研究报道，氧化损伤在血管内皮细胞功能障碍和心血管疾病的发生发展过程中起很重要的作用［15］，还导致动脉粥样硬化、糖尿病、肿瘤等疾病的发生［16］。心血管疾病是全世界主要致死致残的主要原因之一，且内皮细胞和心肌细胞氧化损伤是涉及心血管疾病的两大主要因素。

山银花黄酮类化合物抗氧化作用的研究还处于初级阶段，尚未深入到分子机理水平，临床运用也仅作为一味中药使用，黄酮类化合物在体内的吸收和代谢规律等也有待进一步研究。

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